VEGF在不同皮肤扩张方式中表达的意义

常谨等

[摘要]目的：探讨VEGF在不同皮肤扩张方式中的表达与扩张皮瓣中新生血管的形成关系，建立适合于临床的最佳的皮肤扩张方式。方法：选用62只新西兰大白兔随机分为5大组，随机将动物按不同扩张方式分为5组：A组（反复快速扩张组）、B组（快速扩张组）、C组（常规扩张组）、D组（植入不扩组）、E组（正常对照组），采用免疫组织化学染色观察扩张皮瓣中VEGF的表达情况。结果：在维持1周，A组的VEGF表达明显高于B组和C组（P<0.05），B组与C组差异不明显（P>0.05）；在维持2、3、4周A组与B组、C组比较均无显著性差异（P>0.05）；在维持6周，A组的VEGF表达与B组比较无显著性差异（P>0.05）；维持6周的A组和B组的VEGF表达明显高于维持4周的C组（P<0.05）。结论：反复快速皮肤扩张可明显提高扩张皮瓣中VEGF的合成与分泌，促进血管形成。

[关键词]皮肤扩张术；血管生成；血管内皮生长因子（VEGF）

[中图分类号]R622R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）10-0-0

目前皮肤软组织扩张术已广泛应用于整形外科中[1-6]，成为整形外科的重要治疗手段和常用的基本技术。临床上应用最多的扩张方式为常规扩张方式。但此法疗程较长、并发症多[7-12]。国内外学者对此发展了各种快速扩张方式[13-16]，这些方法均不同程度上缩短了疗程，但可能导致组织坏死，还存在诸如回缩率较高、操作繁琐、设备昂贵等弊端。近年微创技术的出现有效减少了并发症[17]。本研究结合目前临床常用的常规扩张法与快速扩张法的特点，拟采用一种新型的皮肤软组织扩张方式-反复快速皮肤扩张，通过对新西兰大白兔皮肤扩张，应用免疫组织化学的方法，观察反复快速皮肤扩张对皮瓣血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响，并探讨建立更适应于临床的皮肤扩张方式提供实验依据。

1材料与方法

1.1 实验动物：62只雄性新西兰大白兔，6月龄，体重2～3kg，由河北医科大学动物实验中心提供，冀医动管字610063号。动物分笼饲养，统一饲料，自由饮食。

1.2 动物分组：随机将动物按不同扩张方式分为5组：A组（反复快速扩张组）、B组（快速扩张组）、C组（常规扩张组）、D组（植入不扩组）、E组（正常对照组），A、B组每组20只动物，C组16只动物，D组5只动物，E组1只动物。

1.3 皮肤扩张动物模型制备：手术区备皮，术前称量体重，2.5g/L戊巴比妥钠（25mg/Kg）于耳缘静脉注射行全身麻醉。麻醉显效后，常规消毒手术区、铺无菌巾。自两耳根后缘连线间，横行切开长约2.5cm皮肤切口，切开皮肤及皮下组织，血管钳向前钝性分离头部皮肤与颅骨骨膜的疏松附着，分离范围：两侧近眶骨上缘1cm，前部距鼻翼2cm处。自皮肤切口处，于植入腔内植入容量为50ml的肾形扩张器，上海东月医疗保健用品有限公司产，产品批号：050301。植入前自注射壶注射无菌生理盐水检查扩张器有无渗漏。注射壶埋入颈部皮下，严密缝合皮肤切口。自注射壶注入无菌生理盐水5ml。术毕即刻肌肉注射庆大霉素8万单位，术后每日肌肉注射庆大霉素8万单位至术后3天。扩张器植入术后第3天开始扩张皮肤（见图1）。

1.3.1 A组：每日扩张1次；每次自注射壶注入无菌生理盐水20ml， 维持30min；然后抽出全部注入液体，间隔3h；照上述方法反复3次，最后一次抽出15ml液体，扩张器内留置5ml无菌生理盐水。每日重复上述步骤，10日完成注水。

1.3.2 B组：每日扩张1次；每次自注射壶注入无菌生理盐水5ml，10日完成注水。

1.3.3 C组：每3日扩张1次；每次自注射壶注入无菌生理盐水5ml，28日完成注水。

1.4 标本采集与处理：A、B组分别于扩张完成后维持1周、2周、3周、4周、6周；C组分别于扩张完成后维持1周、2周、3周、4周随机抽取4只动物留取标本。D组分别于植入扩张器后1周、2周、3周、4周、6周随机抽取1只动物留取标本。修剪表面毛发后，全麻下于扩张皮瓣中央处切取约1cm×1cm大小的扩张全层皮肤组织块。投入10%甲醛溶液中固定，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成4μm连续切片。进行VEGF免疫组织化学观察。

1.5 VEGF阳性判定标准：VEGF表达主要见于细胞浆内，表现为棕黄色颗粒或黄褐色颗粒分布于胞浆中。VEGF阳性表达以胞浆胞膜有棕黄色颗粒为准。VEGF在上皮细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞均有表达。

1.6 VEGF含量的判定：采用计算机自动图像分析系统在高倍镜下（200×）沿皮肤纹路随机选取5个不同的皮肤组织区域，测定其阳性细胞所占比例，以阳性细胞染色的积分光度值（integrated optical density， IOD）来表示抗原表达量。阳性染色的积分光度越高，说明阳性细胞数量越多。

1.7 统计学处理：VEGF计量资料用均数±标准差（x±s）来表示，运用SPSS 11.5软件包进行统计学分析。以P<0.05具有统计学意义。

2结果

2.1 一般情况：动物实验过程中，所有实验动物未出现感染、扩张器外露、皮瓣坏死等并发症，均成活到预定观察时间。

2.2HE染色组织学观察：A、B、C组：维持1、2周时，微血管明显增生，排列密集，管腔较小，圆形或类圆形，主要集中于真皮乳头层、网状层以及毛囊周围；维持4周时，血管数量较多，排列较密集，管腔较大。

D组：血管增生不明显，管腔明显，排列比较稀疏，可见一些小血管稀疏排列在真皮浅层、网状层和毛囊周围。

2.3VEGF的表达：VEGF的染色特点：VEGF的阳性定位于细胞的胞浆，反应物质呈黄色颗粒状，表达较强时为棕黄色。VEGF主要表达于上皮细胞，成纤维细胞、血管内皮细胞亦可以见阳性染色，在毛囊细胞及皮脂腺细胞也可见表达（见图2～3）。

A、B、C三组在维持1周VEGF的表达均处于较高水平（见图4），随着维持时间的延长，VEGF的表达呈下降趋势，在维持4周时（见图5），VEGF的表达接近正常皮肤的水平，而后再次升高（表1）。

在维持1周，A组的VEGF表达明显高于B组和C组（P<0.05），B组与C组差异不明显（P>0.05）；在维持2、3、4周，A组与B组、C组比较均无显著性差异（P>0.05）；在维持6周，A组的VEGF表达与B组比较无显著性差异（P>0.05）；维持6周的A组、B组VEGF表达明显高于维持4周的C组（P<0.05）（表2）。

3讨论

3.1 VEGF也称血管通透性因子（vascular permeability factor， VPF）或促血管素，最初是由培养的肿瘤细胞中发现的一种新型生长因子，能增加微小血管通透性。随后发现该因子能特异性地作用于血管内皮细胞，并促进其增殖，因此命名为VEGF。VFGF通过和血管内皮细胞的特异性受体结合，具有促内皮增殖、促血管生成作用，其它血管生成因子的血管生成作用是全部或部分通过增强VFGF的表达及生成作用实现的。VFGF的生物学特性主要表现在两方面：增加微血管的通透性和特异性的与血管内皮细胞受体结合，促进血管内皮细胞的分裂和增殖进而导致新生血管的生成。

3.2 扩张后扩张皮肤微血管的变化是一个复杂的过程，受内皮细胞生长因子等多种血管活性因子的影响。早期研究表明在扩张的组织中细胞活性增加[18-19]。扩张时增加了皮肤局部缺血、缺氧程度[18，20-21]，局部缺血造成VEGF的合成、分泌增加。皮肤扩张除可产生额外的皮肤组织，且能明显促进血管增生。Lantieri等[22]采用免疫组织化学方法，首次发现扩张皮肤组织内VEGF表达增多，在真皮浅层、毛囊及皮脂腺均可见强烈表达，证明在组织扩张时局部缺血诱导产生VEGF可能是组织扩张中血管发生的一个机制。

3.3 本实验研究发现，皮肤组织在受到扩张刺激后，VEGF合成与释放增加，三种扩张方式均可造成扩张皮肤组织中VEGF的高表达。三组扩张皮肤组织中VEGF的高表达在维持前期保持在较高水平，在维持期2周时表现为急速下降趋势，以后呈平稳下降趋势，在维持期4周时，VEGF的表达下降至正常水平。可能的原因：长期的缺血、缺氧致细胞的代偿性活性增强，VEGF合成、分泌增加，至维持期第2周时，失代偿后细胞凋亡，VEGF合成、分泌减少；造成VEGF的表达在维持期2周时的急速下降趋势。折线图中显示反复快速扩张组的VEGF表达高于快速扩张组和常规扩张组。表明：反复快速扩张的刺激，增加了组织细胞的活性，促进了VEGF合成、分泌的增加，而VEGF分泌的增加，又进一步促进了内皮细胞增殖，促使扩张皮瓣中血管增生。随着维持时间的延长，局部缺血、缺氧程度逐渐减轻，VEGF的表达趋于正常水平。

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[收稿日期]2012-06-28[修回日期]2012-08-27

编辑/张惠娟