翼状胬肉中MMP—2和Ki—67的表达及临床意义

顾秋艳

[摘要]目的：研究基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和Ki-67在翼状胬肉组织中的表达及临床意义。方法：应用辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素免疫组织化学方法（S-P法）对39例原发性翼状胬肉及12例正常球结膜组织中的MMP-2及Ki-67蛋白进行检测。结果：MMP-2及Ki-67蛋白在翼状胬肉组织中的表达均高于正常结膜组，差异有显著性意义（Z=-3.044，Z=-2.707，P均<0.05）。结论：MMP-2及Ki-67在翼状胬肉中的表达明显高于正常球结膜，提示翼状胬肉组织中基底膜分解代谢和细胞增殖调控等方面发生异常了变化，在翼状胬肉的发生发展中可能起着重要的作用。

[关键词]翼状胬肉；MMP-2；Ki-67；免疫组织化学

[中图分类号]R777.33 [文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1971-03

翼状胬肉是临床常见眼表病之一，发病普遍认为与紫外线照射、气候干燥、接触粉尘油烟等有关。表现为呈三角形增厚的球结膜组织病变，头部侵袭生长至角膜，导致病人视功能下降，但其确切的发病机制至今仍不甚明了[1]。基质金属蛋白酶2（MMP-2）是MMps家族成员之一，对细胞外基质（ECM）有广泛的降解作用。MMP-2在翼状胬肉中参与ECM的破坏及新生血管的形成而备受关注。Ki-67是存在于增殖细胞核基质内的抗原，其增殖指数可以敏感地反映出细胞的增殖活性。翼状胬肉组织存在异常增殖调控，使胬肉上皮及间质细胞和正常结膜处于不同细胞分裂周期。我们运用免疫组织化学技术，检测39例翼状胬肉，12例正常球结膜标本中MMP-2和Ki-67的表达，探讨其在翼状胬肉组织中的表达情况，从分子水平进一步探讨翼状胬肉发病机制，为胬肉的化学药物治疗和靶向治疗提供一定的思路。

1材料和方法

1.1 标本来源：收集原发性翼状胬肉组织标本39例，来自于2009年3月～2009年7月在河北省眼病治疗中心进行翼状胬肉切除术的患者。其中男性21例，女性18例；平均年龄60.5岁；静止期12例，进展期27例。病程6个月～30年不等；生长部位：鼻侧38例，颞侧1例；对照组取正常球结膜12例，取材部位为鼻侧睑裂部近角巩膜缘球结膜组织。其中男性7例，女性5例；平均年龄41.2岁。所有病例术前均排除其他角膜及结膜疾病，近3个月无眼部用药史及手术史。

1.2 实验试剂：鼠抗人MMP-2单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司（产品编号sc-13595）；鼠抗人Ki-67单克隆抗体浓缩液（北京中杉金桥生物技术有限公司），产品编号ZM-0166；S-P免疫组化试剂盒、浓缩型显色剂二氨基联苯胺（DAB）试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法：免疫组织化学染色（S-P法）：标本经10%中性福尔马林固定24h后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋。5μm连续切片后，经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水；于湿盒内用3%H2O2溶液室温孵育20min去除内源性过氧化氢酶；枸橼酸盐缓冲液微波抗原热修复；正常山羊血清封闭；分别滴加由0.01M PBS稀释的MMP-2及Ki-67的一抗，工作浓度均为1：50；切片放入湿盒中，4℃冰箱过夜；分别滴加生物素标记的二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液， 37℃温箱孵育30min；DAB显色，显微镜下观察显色情况，自来水充分冲洗中止显色。苏木素复染，常规脱水透明封片。以0.01M 磷酸盐缓冲液（PBS）液替代一抗做阴性对照，将已知阳性切片作为阳性对照。

1.4结果判定MMP-2的表达情况根据染色强度及染色阳性细胞的百分率来计分。阳性细胞数≤10%为0分；在10%～25%为1分；在26%～50%为2分；>51%为3分；染色强度计分标准：无色计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；黄褐色计3分。分值计算：将两种计分结果相乘并分为以下等级：0分：为阴性（-）；1～2分：为弱阳性（+）；3～4分：为阳性（++）；5分～：为强阳性（+++）。Ki-67定位于细胞核，阳性反应为细胞核呈棕褐色、颗粒状。Ki-67蛋白评分标准：在400倍视野下计数500个细胞，阳性细胞<5%为阴性（-），5%～25%为弱阳性（+），26%～50%为阳性（++），>50%为强阳性（+++）。>25%即为Ki-67高表达。

1.5统计学方法 所有数据采用SPSS15.0统计软件包进行秩和检验和Spearman等级相关分析。以a=0.05为检验水准，P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1 MMP-2蛋白的表达正常球结膜组织中未见MMP-2表达（图1），翼状胬肉组织中MMP-2呈阳性表达，阳性物质位于近基底部的上皮层细胞的胞浆中，呈弥漫性或散在分布的棕黄色或棕褐色颗粒状（图2），差异有显著性意义（P<0.05） （表1）。39例翼状胬肉标本中，静止期MMP-2阳性表达率为50%（6/12），进展期阳性表达率为51.8%（14/27），静止期和进展期MMP-2阳性表达率比较无显著性差异（P>0.05）。不同性别和不同年龄组MMP-2阳性表达亦无显著性差异（P>0.05）（表1）。

2.2 Ki-67蛋白的表达：正常球结膜组织中仅有少量上皮层的基底细胞表达Ki-67，阳性率为25%（3/12）（图3）。翼状胬肉Ki-67的阳性表达主要分布在上皮组织，以上皮的基底细胞为明显，染色呈细胞核型，为棕黄色到棕褐色颗粒，基质层亦有少量表达（图4）。Ki-67在翼状胬肉中的阳性表达高于正常结膜组织，差异有显著性意义（P<0.05）。39例翼状胬肉标本中，静止期Ki-67阳性表达率为（33.3%） （4/12），进展期阳性表达率为77.8%（21/27），进展期Ki-67蛋白表达明显高于静止期，统计学处理有显著性差异（P<0.05）。不同性别和不同年龄组Ki-67阳性表达亦无显著性差异（P>0.05）（表1）。

2.3 翼状胬肉MMP-2与Ki-67表达相关性分析：胬肉中MMP-2和Ki-67的表达进行Spearman等级相关分析，二者表达不具相关性（r=0.037，P>0.05）（表2）。

3讨论

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）是一类依赖金属锌离子的蛋白水解酶家族。通过多种机制如：水解细胞外基质、组织重建、血管生成和肿瘤转移等参与多种生理、病理过程[2]。MMP-2又称明胶酶，其底物是IV型胶原。Girolamo[3]首次报道MMP在翼状胬肉和培养的胬肉上皮细胞中的表达，参与了胬肉生长过程的炎症、组织基质重塑和血管的发生。Dushku等[4]发现多种MMP在胬肉组织中表达，检测到MMP 2、3、7、9、14、15的过度表达。

本次研究实验显示， 39例翼状胬肉组织阳性表达率为51.2（20/39），正常球结膜上皮未见MMP-2阳性表达，与Di等[5]研究结果相同。Zeng等[6]用明胶酶谱分析得出的结果与我们的组化结果一致。袁静等[7]用培养的结膜及翼状胬肉上皮细胞检测MMP-2表达，发现翼状胬肉上皮细胞MMP-2在蛋白及基因水平的表达较结膜上皮细胞明显增加。Yang[8]等研究亦表明在培养的翼状胬肉成纤维细胞中MMP-2表达高于正常结膜组织和细胞。翼状胬肉上皮细胞异常分泌MMP-2，导致前弹力层溶解，突破了 Bowman氏膜屏障，使胬肉细胞向角膜及深层浸润[6]。

Ki-67抗原是由Gerdes[9]于1983年在增殖细胞中发现的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志基因。Ki-67的表达出现于G1中期到晚期，S期和G2期逐渐增加，有丝分裂期达高峰，分裂后迅速降解或丢失抗原决定簇，到G0期则不表达，半衰期为1h或更短。它是一个反映细胞增殖率的可靠指标，因为几乎所有组织中都有Ki-67表达。其高表达是细胞增殖活跃的重要标记。多种肿瘤组织都有Ki-67高表达[10]，Ki-67对肿瘤的转移及预后判断也具有重要意义。

本次研究实验显示，Ki-67在翼状胬肉近基底膜的上皮细胞层呈阳性表达。39例翼状胬肉组织中的阳性表达率为64.1%（25/39），明显高于正常球结膜组织，与他人研究结果一致[11]。说明翼状胬肉组织存在异常的增殖调控，胬肉的上皮及间质细胞和正常结膜处于不同的细胞分裂周期，导致组织过度增殖。进展期胬肉Ki-67阳性表达（77.8%）明显高于静止期胬肉（33.3%），经统计学分析具有显著性差异（P<0.05），说明进展期翼状胬肉细胞的增殖活跃，翼状胬肉组织中存在增殖调控异常。

通过对MMP-2和Ki-67在胬肉中的表达进行Spearman等级相关分析，二者表达不具相关性（r=0.037，P>0.05）。提示这两种蛋白是通过破坏细胞ECM和异常增殖等不同作用机制促使球结膜组织发生改变，导致翼状胬肉的发生。

综上所述，MMP-2及Ki-67在翼状胬肉中的表达明显高于正常球结膜，说明翼状胬肉组织中基底膜分解代谢和细胞增殖调控等方面发生异常了变化，在翼状胬肉的发生发展中起着重要的作用。

[参考文献]

[1]朱雅琴，姚克.翼状胬肉发病机制研究进展[J].国外医学：眼科学分册，2005，29（3）：163- 165.

[2]Malemud CJ. Matrixmetalloproteinases （MMPs） in health and disease：an overview[ J]. Front B iosci，2006， 11：1696-1701.

[3] Di Girolamo N，McCluskey P， Lloyd A，et al.Experssion of MMPs and TIMPs in human pterygia and cultured pterygium epithelial cells.[J] Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（3）：671-679.

[4]Dushku N， John MK， Sohultz GS， et al.Pterygia pathogenes is corneal invasion by matrix meta lloproteinase expression altered lmibal epithe lialhasal cells[J].Arch Ophthalmol， 2001，119（5）：695-706.

[5]Di GN，Wakefield D， Coroneo MT. Differential Expression of Matrix Metalloproteinase and Their Tissue Inhibitors at the Advancing Pterygium Head [J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2000，41（13）：4142-4149.

[6]Jun Zeng， Jiang DY， Liu XP， et al. Expression of MatrixMetalloproteinase in Human Pterygia[J]. Eye Science， 2004，20（4）：22-24.

[7]袁静，胡燕华，王适群.翼状胬肉上皮细胞基质金属蛋白酶Ⅱ的表达[J].眼科研究，2004，22（5）：511.

[8]Yang SF， Lin CY， Yang PY， et al.Increased expression of gelatinase （MMP-2 and MMP-9） in pterygia and pterygium fibroblasts with disease progression and activation of protein kinase C[J].Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009，50（10）：4588-4596.

[9]Gerdes J， Lemke H， Baisch H，et al.Cell cycle analysis of a cellproliferation associated human nuclear antigen defined by the mono clonal antibody Ki67[J].J lmmunol，1984，l33（4）：l710-1715.

[10]Liu M， Lawson G，Delos M，et a1.Predictive vale of the fraction of cancer cells immunolabeled for proliferating cell nuclear antigen or Ki67 in biopsies of head and neck carcinomas to identify lymph node metastasis，comparison with clinical and radiologic examinations[J].Head Neck，2003，25（4）：280-288.

[11]李海燕，刘克兰，袁志刚，等.翼状胬肉中Ki-67和VEGF的表达[J].中国实用眼科杂志，2006，24（9）：946-948.

[收稿日期]2012-06-19[修回日期]2012-08-25

编辑/张惠娟