EGCG对中波紫外线辐射后原代人角质形成细胞中光产物产生和清除的影响

林向飞　闵玮　朱晓芳　骆丹

[摘要]目的：观察中波紫外线（UVB）辐射后人原代角质形成细胞中环丁烷嘧啶二聚体（cyclobutane pyrimidine dimmers，CPDs）的生成和清除情况，以及没食子儿茶素没食子酸酯 （epigallocatechingallate，EGCG）干预对上述过程的影响。方法：以不同剂量UVB照射原代角质形成细胞后并加入EGCG干预处理，采用免疫组织化学法检测UVB照射后不同时段细胞中CPDs的产生和清除情况。结果： UVB照射后细胞中CPDs开始产生，1h左右达到高峰；CPDs在照光后4h内清除速率较快，4h后清除速率逐渐降低，至24hCPDs被基本清除。照光前后加入EGCG干预减少UVB引起的35.7%～42.9%CPDs产生（P<0.05）。结论：UVB可明显引起原代人角质形成细胞损伤，受损程度随辐射剂量增大而加重；EGCG可以减少UVB辐射所致的光产物的产生，加速光产物的清除。

[关键词]UVB辐射；人原代角质形成细胞；环丁烷嘧啶二聚体；EGCG

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1967-04

日光中和皮肤癌相关的紫外线可以分为UVA（320～400nm）、UVB（280～320nm）、UVC（200～280nm）。UVB可导致DNA的标志性损伤即光产物形成[1-2]，包括6-4光产物（（6-4）PPs）和嘧啶或环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）。CPDs约占75%左右，是主要的光产物。这些DNA损伤如没有修复或修复不完善，可以产生基因突变，成为皮肤癌的初始改变。生物体天然固有切除和修复光产物的能力，这种切除修复能力会受到多种外界因素如药物的影响。现有研究表明绿茶提取物茶多酚（Teapol， TP）中的主要活性成分EGCG具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种作用，既往我们已报道EGCG有较强的抗紫外线能力，但其对UVB辐射后人皮肤原代KC中光产物产生及清除的影响还未见报道[3-6]。本研究主要观察UVB辐射后人皮肤原代KC中CPDs产生和清除的情况，以及EGCG对上述过程的影响。

1材料和方法

1.1 材料与仪器：EGCG（美国Sigma生物公司）；K-SFM培养基（美国 GIBCO生物公司）；加人中性蛋白酶（Dispase）（美國Sigma生物公司）；CPDs单克隆抗体（美国Sigma生物公司）；免疫组化试剂盒和 DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。SUV-100日光紫外线模拟器及UVB辐照度监示器（上海西格玛高技术有限公司），EGCG溶液配制浓度为1mg/ml。

1.2 人原代KC的分离与培养：参照文献方法[4]，将正常成人环切术后的包皮用碘伏浸泡，漂洗3次；剪成0.5cm×0.5cm大小皮片；0.5%中性蛋白酶 4℃下消化16～18h，分离真、表皮；表皮部分用表皮消化液（0.1% 胰蛋白酶：0.01% EDTA=1：1）在37℃下消化10～12min后200目尼龙网过滤，离心，加入K-SFM培养基于37 C、5% CO2下培养。培养的细胞以调整浓度为1×106/ml，定量接种于直径3.5cm培养皿中继续培养。待细胞长至70%～80%融合时用于实验。

1.3 细胞爬片：将24mm×24mm的盖玻片泡酸、冲洗、烘干、消毒备用。将原代KC调整其浓度为1×106/ml，将无菌盖玻片放入6孔板中，每张滴加0.6ml细胞悬液继续培养。细胞80%融合后进行EGCG干预处理及UVB照射。

1.4 UVB照射及EGCG干预处理：将原代KC分为对照组、时间组、剂量组和EGCG处理组。时间组以30mJ/cm2UVB照射，照光后1h、4h、8h、12h及24h进行实验；剂量组接受不同剂量（30、60和90mJ/cm2）UVB辐射，辐射后4h进行免疫组化实验；EGCG组以30mJ/cm2UVB辐射，照光前4h及照光后加入200μg/ml EGCG与细胞共孵育，4h后进行检测。每组设3个平行培养孔。UVB辐照剂量=UVB辐照度×时间（s）。

1.5 免疫组织化学法检测CPDs：按说明书进行操作。盖玻片以丙酮液固定，滴加1：1000稀释的鼠抗人CPDs单抗，以DAB显色及苏木素复染，经脱水、透明及封片后显微镜下观察拍照。阳性细胞为胞核棕黄色着色，连续观察5～10个高倍视野（×400），计数200个细胞总数的阳性细胞数， 采用u检验进行统计分析。

2结果

2.1 UVB辐射导致人原代KC中CPDs生成：如图1A到图1C所示，UVB辐射可以损伤细胞，引起光产物产生，我们采用免疫组织化学法检测CPDs的产生情况，有CPDs生成的细胞在图中表现为具有棕褐色细胞核的阳性细胞。有下图可见，UVB照射后，出现了大量CPDs阳性细胞，而与照光组相比，非照光组和对照组（以PBS代替一抗作为阴性对照）均未见到阳性细胞。

2.2 UVB辐射后24h内细胞光产物产生和清除情况：原代KC接受UVB辐射后24h内在不同时间点（0、1、4、8、12和24h）检测CPDs的产生和清除情况，显微镜下计数阳性细胞个数，见表1。胞核弥漫性棕褐色着色为阳性细胞，连续观察5～10个高倍视野（×400），计数200个细胞总数中的阳性细胞数。从图2A到图2G中可以看出UVB辐射后光产物产生量逐渐增多，1h左右达到高峰；同时细胞也开始清除光产物，辐射后4h内清除速率较快，辐射后4～24h清除速率逐渐降低，最终光产物被基本清除；各组间差异有统计学意义（P<0.05），表1。

2.3 UVB照射剂量对细胞损伤的影响：原代KC进行细胞爬片，然后接受不同剂量（0、30、60、90mJ/cm2）UVB照射，4h后进行免疫组化实验。从图3A到图3C可以看出，30mJ/cm2UVB照射后镜下的阳性细胞最少， 60mJ/cm2 UVB对细胞的损伤作用增大，阳性细胞数增多；90mJ/cm2 UVB损伤作用最强，阳性细胞数最多，这显示UVB对原代KC的损伤作用呈剂量依赖性，各组间差异有统计学意义（P<0.05），表2。

2.4 EGCG对UVB辐射后光产物的产生和清除的影响：从图4A到图4C可以看出，UVB辐射前后加入EGCG处理细胞，细胞的损伤均较单纯照射组轻，表现为光学显微镜下的阳性细胞均较单纯照射组少。结果表明EGCG能够减轻UVB辐射对细胞的损伤，既能减少光产物的产生，也可以加快光产物的清除，各组间差异有统计学意义（P<0.05），表3。

该资料符合Possion分布，对数据进行u检验。uEGCG+UVB组>1.96，P<0.05，uUVB+EGCG组>1.96，P<0.05，差别均有统计学意义。

3讨论

UVB（280～320nm）诱发红斑和日晒伤，并与皮肤癌密切相关[7]。表皮细胞DNA直接吸收UVB的能量而产生光损伤。环氧嘧啶二聚体（CPDs）是最主要的DNA光损伤形式[8]，可以导致基因突变如C→T或CC→TT转换，成为皮肤癌的初始突变。皮肤细胞有多种DNA修复途径，可以依据紫外线介导不同损伤的类型来去除DNA损伤。UVB辐射产生的CPDs主要由核苷酸切除修复（NER）[9]。

茶多酚是绿茶提取物，其主要有效单体成分为没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG，它有着广泛的生物学效应，如抗突变、抗肿瘤形成、抗炎抗病毒及清除自由基和抗氧化等[10]。研究证实，服用绿茶或其提取物（GTP，EGCG）可抑制多种肿瘤的产生[11]。本部分以原代KC为研究对象，采用免疫组织化学方法来观察和檢测UVB辐射后原代KC中CPDs的产生和清除情况。我们分别检测了照光后不同时间点的CPDs阳性细胞数量以动态分析CPDs的产生与清除过程，同时还检测了不同紫外线强度以及加入EGCG干预条件下CPDs生成量的变化。实验结果表明，UVB辐射可以导致细胞DNA损伤，产生CPDs，照光后1h左右达到高峰。同时细胞自身也清除光产物，在开始的4h内清除速率较快；辐射后4h到24h，CPDs清除速率减慢。我们同时也观察了不同剂量（30、60、90mJ/cm2）UVB对细胞损伤的影响，结果表明随着UVB辐射剂量的增大，阳性细胞数目增多，显示出UVB对原代KC的损伤作用呈剂量依赖性，UVB辐射强度越大，CPDs产生越多；然而，随着UVB剂量的进一步增大，可能导致细胞直接坏死或凋亡，而不反映为CPDs产生增加，对此我们将在进一步研究中进行观察和分析。照光前后加入EGCG与细胞共同孵育，镜下阳性细胞数明显少于UVB照射组，这证实了EGCG的光保护作用，它可以抵抗紫外线，减少CPDs的产生。UVB辐射后立即分别加入EGCG溶液，与细胞共同孵育4h后进行检测，光学显微镜下阳性细胞数也明显少于UVB照射组，显示出EGCG可以加快光产物的清除，对细胞有光保护作用。

总之，UVB辐射可以导致原代KC的DNA损伤，产生光产物（CPDs）。辐射后细胞对光产物的清除存在快速清除期（0～4h），以及随后的慢速清除期（4～24h）。细胞损伤的程度与UVB辐射的剂量存在着密切关系，随剂量增大而加重。UVB辐射前后加入EGCG可以减少光产物的产生和加快光产物的清除。

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[收稿日期]2012-06-25 [修回日期]2012-08-20

编辑/张惠娟