SFRP2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

王儆等

[摘要]目的：成功构建携带SFRP2基因的腺病毒载体。方法：从pGBKT-SFRP2质粒中扩增SFRP2基因，将SFRP2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV。用脂质体转染法将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEasy-1共转染293细胞，成功构建的重组腺病毒Ad-SFRP2，确定转染效率。原代培养增生性瘢痕成纤维细胞，利用Ad-SFRP2感染该细胞。通过RT-PCR和Western Blot分别检测感染后人瘢痕成纤维细胞及对照组细胞中SFRP2基因mRNA和蛋白表达水平。结果：RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-SFRP2的PCR产物约为904bp，SFRP2 mRNA表达水平明显增高；用抗SFRP2多克隆抗体进行Western blot检测为阳性，感染的重组腺病毒载体在人瘢痕成纤维细胞中SFRP2蛋白有较高的稳定表达。结论：成功构建含有人SFRP2基因的重组腺病毒Ad-SFRP2；它可有效提高人增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2基因的表达水平。

[关键词]SFRP2；腺病毒；增生性瘢痕；成纤维细胞

[中图分类号]R318[文献标识码] [文章编号]1008-6455（2012）11-1981-04

成纤维细胞作为创伤愈合时的主要效应细胞，在包含增生性瘢痕和瘢痕疙瘩在内诸多以过度增生为特征的病变中，常常表现为凋亡抑制，进而引发一系列连锁反应造成创面修复失控并最终导致过度纤维化而形成增生性瘢痕[1]。我们过去运用从基因芯片中筛选出一个具有抑制细胞凋亡作用、在早期增生性瘢痕中呈显著高表达的基因SFRP2[2-3]，该基因可能在增生性瘢痕形成的过程中起着重要作用。但是目前SFRP2调控增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制尚不明了，有必要进行进一步研究。

本实验利用pAd-Easy腺病毒载体系统[4]，通过PCR扩增SFRP2基因，克隆到腺病毒载体pAdEasy共转染293细胞，构建携带SFRP2基因的重组腺病毒，在体外感染人增生性瘢痕成纤维细胞以观察SFRP2基因表达情况，为进一步研究该基因的功能奠定理论和实验基础。

1材料和方法

1.1 材料：pGBKT-SFRP2质粒（袁顺宗博士惠赠）。感受态菌株及293细胞株（我院烧伤研究所）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Haclon公司）。限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、pMD18-T载体、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL15000（Takara公司）。Lipofectamine2000（Invitrogen公司）。Trizol及RT-PCR试剂（美国Invitrogen公司）。逆转录试剂盒（美国Fermentas公司）。兔抗人SFRP2多克隆抗体（美国CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 增生性瘢痕成纤维细胞的分离培养：采用组织块法[6]进行增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养，具体方法如下：将手术中取下的增生性瘢痕标本仔细切除皮下脂肪组织和表皮，用加有青霉素和链霉素的消毒蒸馏水洗涤3次，再用消毒生理盐水漂洗3次；在少量含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中用锋利的刀片将组织切割成约1mm大小的块，并接种于25ml的培养瓶中，置于37℃，5% CO2的孵箱中培养，待长成致密层以后，用2.5g/L的胰蛋白酶消化传代，实验所用的是第3～6代的细胞。

1.2.2 SFRP2编码序列的扩增：采用Primer5.0软件设计扩增人SFRP2基因氨基酸区域编码序列的特异性引物，并在引物5'端引入保护性碱基和限制性酶切位点，其中，上游引物序列为：5'-GAAGATCT ATGCTGCAGGGCCCTGGC-3'，下游引物序列为：5'-TTGTCGAC CTAGCACTGCAGCTTGCGGATG-3'（画线部分分别为BglII和SalI酶切位点）。以pGBKT-SFRP2质粒为模板进行PCR扩增，扩增体系组成为：5μl 10×PCR缓冲液、1μl 10mmol/L dNTPs、pGEX-IL-24重组质粒模板2μl、10μmol/L引物各1μl及DNA聚合酶1μl，用双蒸水补足至50μl。扩增程序为：94℃变性5 min，然后用逐步程序94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min完成30个循环，最后72℃延伸7 min。

1.2.3SFRP2重组腺病毒表达载体的构建：2%琼脂糖凝胶回收SFRP2扩增产物，与pMD19-T载体连接并转化到DH5α菌中，蓝白斑初步筛选，挑取单菌落提粒，BglII和SalI双酶切及PCR鉴定，鉴定正确的质粒经BglII和SalI双酶切，胶回收SFRP2目的片段，与线性化的pAdTrack-CMV载体相连接，转化DH5α菌，BglII和SalI双酶切鉴定并进行测序。测序正确的重组载体命名为pAdTrack-CMV-SFRP2。PmeⅠ单酶切消化10μg pAdTrack-CMV-SFRP2重组质粒，纯化回收后获得线性化载体，然后与0.1μg骨架质粒pAdEasy-1在2.5 kV，200Ω，25μF条件下电穿孔共转化20μl BJ5183感受态细胞，卡那霉素抗性平板37℃培养16 h，挑取针尖大小的克隆，PacⅠ酶切鉴定正确后，再转化DH5α菌中扩增。鉴定正确的重组载体命名为Ad-SFRP2，进行扫描获取图像。

1.2.4 SFRP2重组腺病毒的包装与制备：按照Lipofectamine2000试剂盒说明书，取10μgPacⅠ酶切线性化的Ad-SFRP2转染HEK293细胞。转染后7～10天荧光显微镜观察，根据绿色荧光蛋白GFP和细胞病变效应判断病毒产生。收集细胞，磷酸盐缓冲液重悬，-80℃和37℃反复冻融4次，12 000 r/min离心10 min，收集病毒上清，-80℃保存，取部分病毒上清液，再次感染HEK293细胞扩增腺病毒，按TCID法测定病毒滴度。

1.2.5 SFRP2重组腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞：原代培养的增生性瘢痕成纤维细胞经第3次传代后，在150 mL/LDMEM中培养24h。将Ad-SFRP2纯化病毒按其TCID50值加入到细胞培养基中，每15min轻摇1次，共4次，4h后换液。

1.2.6 RT-PCR检测SFRP2表达水平：按Trizol试剂盒说明书分别提取Ad-SFRP2感染24h后的实验组和阴性对照组增生性瘢痕成纤维细胞的总RNA。RT-PCR反应按照Fermentas反转录PCR试剂盒说明书进行操作，利用PrimerPrimer 5.0设计SFRP2的鉴定引物：上游5'-TGGGGGAAACGGTCGCACTC-3'，下游5'-GGCCACGAGACCATGAAGGAGG-3′。 PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s，退火56℃30s，延伸72℃40s，35个循环；最后延伸72℃5 min。以GAPDH作为内参照（退火温度55℃，25个循环），GAPDH上游引物5'-ACCCATCACCATCTTCCA GGAG-3'，下游引物5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'（上海生物工程技术服务有限公司合成），PCR反应结束后取10μL反应产物行10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察目的条带。

1.2.7 Western blot检测SFRP2表达水平：分别收集感染Ad-SFRP2 24h后和对照组细胞，提取蛋白。BCA法进行蛋白定量，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，沸水浴5min，按照蛋白定量结果进行加样，行120g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用半干法将蛋白转移至硝酸纤维素（NC）膜上。NC膜用50g/L脱脂奶封闭1h，加入SFRP2 pAb （1∶500）或GAPDH mAb（1∶1000）工作液，4℃过夜，兔抗人二抗（1∶4000）于室温下孵育1h，用ECL发光，胶片显色，分析结果，以GAPDH作为内参照。

2结果

2.1 PCR扩增产物电泳结果：以pGBKT-SFRP2质粒为模板，PCR扩增产物为单一条带，大小约904bp，见图1。

2.2 SFRP2重组腺病毒载体的构建：将扩增产物克隆入pMD19-T载体，BglII和SalI双酶切和PCR鉴定确认获得阳性重组克隆（图2）。进而将SFRP2片段亚克隆至pAdTrack-CMV载体，BglII和SalI双酶切鉴定并经测序确认获得阳性重组克隆，命名为pAdTrack-CMV-SFRP2（图3、图4）。线性化的pAdTrack-CMV-SFRP2质粒与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组，PacⅠ酶切鉴定阳性重组子，可见1条约30 kb的片段和1条4.5 kb的小片段（图5），表明同源重组成功，获得SFRP2重组腺病毒载体，命名为Ad-SFRP2。同时，采用同样方法，将pAdTrack-CMV空载体与骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组，重组子命名为Ad-EGFP。

2.3 SFRP2重组腺病毒的包装扩增及鉴定：用脂质体转染293细胞有大量GFP表达，并可见细胞变圆呈串珠样聚集（图6），裂解粗提物中提取重组病毒DNA，PCR鉴定证实重组病毒基因组中含有目的基因SFRP2，提示重组质粒在293细胞转染成功。收集病毒液，反复转染293细胞最终得到滴度约为2.0×1010pfu/mL的重组腺病毒。

2.4 RT-PCR检测结果：感染的增生性瘢痕成纤维细胞中提取mRNA的RT-PCR电泳结果显示，以GAPDH为阳性对照，未感染病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2、感染空病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2与感染SFRP2腺病毒的增生性瘢痕成纤维细胞SFRP2表达一致。其产物为904bp特异条带，且SFRP2腺病毒感染增生性瘢痕成纤维细胞后SFRP2基因表达明显增高（图7）。

2.6 Western blot检测结果：用SFRP2多克隆抗体进行Western blot检测，以GAPDH为阳性对照，结果证实感染重组腺病毒载体在增生性瘢痕成纤维细胞中SFRP2有较高的稳定表达（图8）。

3 讨论

SFRP2是一个位于4号染色体q31.3，其全长约2kb，编码大小约34kD的可溶性蛋白质，表达于胞浆，但也可分泌至胞外发挥作用。SFRP2蛋白所属的SFRP家族具有富含半胱氨酸的结构域，该结构域同源于细胞表面卷曲受体（Frizzled receptors）的Wnt结合位点，但是SFRP2缺乏跨膜结构[5]。目前的研究表明，SFRP2通过调控Wnt信号为主要途径的方式发挥其调节细胞抗凋亡的作用。表现为：①心肌修复过程中，SFRP2通过阻断Wnt3a信号途径、增加细胞核内β-catenin表达以对抗缺氧/复氧诱导的凋亡作用，从而调控心肌细胞修复[6]；②胃癌中过表达的SFRP2通过下调β-catenin-TCF/LEF的下游靶基因如LEF1，cyclin D1，MMP-7等来抑制Wnt信号，调节癌细胞的增殖与凋亡[7]；③乳腺癌中SFRP2主要通过活化NF-κB或抑制JNK信号来发挥其抗凋亡作用。同时SFRP2还可以通过与促进ECM中的纤维连接蛋白-整合素受体复合体（fibronectin-integrin receptor complexes）形成从而活化黏附斑激酶（FAK）及其下游信号途径PI-3K-Akt来抑制细胞凋亡[8]。

除了抑制凋亡之外，SFRP2对细胞增殖、分化和运动也还具有一定的调节作用，并且SFRP2基因的甲基化被认为可用来作为粪便中结直肠癌的筛选标志[9-12]。文献复习还提示SFRP2的高表达可以促进结缔组织生长因子（CTGF）的基因表达水平增高[6]，而CTGF在HS组织中既可以促进Fb增生，又可以促进Fb-肌Fb转分化和胶原合成[13]。

综合上述内容，我们认为SFRP2在增生性瘢痕组织成纤维细胞中的高表达其主要作用可能在于引起成纤维细胞的凋亡抑制，同时还可能与成纤维细胞的增殖相关。根据既往文献研究，我们进一步推测其调节增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的分子机制可能与Wnt信号相关，但也不排除还存在着新的信号途径。然而以上推测尚需进一步的实验证明。

本研究构建SFRP2重组腺病毒载体，在293细胞中表达、包装、纯化病毒后成功构建了携带SFRP2重组腺病毒。并且初步研究结果表明该重组病毒在体外能有效感染正常增生性瘢痕成纤维细胞，受感染细胞能高效稳定的表达重组蛋白，为下一步研究SFRP2对病毒自身的复制与增殖以及宿主细胞中基因表达与调控、细胞凋亡等过程的机制奠定了基础。

[参考文献]

[1]Desmouliere A， Darby IA， Gabbiani G. Normal and pathologic soft tissue remodeling： role of the myofibroblast， with special emphasis on liver and kidney fibrosis[J].Lab Invest，2003， 83（6）：1689-1707.

[2]Wu J， Ma B， Yi S， et al. Gene expression of early hypertrophic scar tissue screened by means of cDNA microarrays[J].J Trauma 2004， 57（6）：1276-1286.

[3]Chen W， Fu X， Sun X， et al. Analysis of differentially expressed genes in keloids and normal skin with cDNA microarray[J].J Surg Res 2003， 113（2）：208-216.

[4]Tong-chuan He，Shibin Zhou，Luis TD，et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J].Proc Nat1 Acad Sci USA，1998，95（6）：2509-2517.

[5]Melkonyan HS， Chang WC， Shapiro JP， et al. SARPs： a family of secreted apoptosis-related proteins[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997， 94pp：13636-13641.

[6]Mirotsou M， Zhang Z， Deb A， et al. Secreted frizzled related protein 2 （Sfrp2） is the key Akt-mesenchymal stem cell-released paracrine factor mediating myocardial survival and repair[J].Proc Natl Acad Sci USA ，2007， 104（5）：1643-1648.

[7]Nojima M， Suzuki H， Toyota M， et al. Frequent epigenetic inactivation of SFRP genes and constitutive activation of Wnt signaling in gastric cancer[J].Oncogene，2007， 23（1）1-15.

[8]Lee JL， Chang CJ， Chueh LL， et al. Secreted frizzled related protein 2 （sFRP2） decreases susceptibility to UV-induced apoptosis in primary culture of canine mammary gland tumors by NF-kappaB activation or JNK suppression[J].Breast Cancer Res Treat，2006，100（1）：49-58.

[9]Lee HX， Ambrosio AL， Reversade B， et al. Embryonic dorsal-ventral signaling： secreted frizzled-related proteins as inhibitors of tolloid proteinases[J].Cell， 2006， 124（1）：147-159.

[10]Oshima T， Abe M， Asano J， et al. Myeloma cells suppress bone formation by secreting a soluble Wnt inhibitor， sFRP-2[J].Blood，2005， 106（12）：3160-3165.

[11]Muller HM， Oberwalder M， Fiegl H， et al. Methylation changes in faecal DNA： a marker for colorectal cancer screening[J]？ Lancet，2004， 363（5）：1283-1285.

[12]Roth W， Wild-Bode C， Platten M， et al. Secreted Frizzled-related proteins inhibit motility and promote growth of human malignant glioma cells[J].Oncogene，2000， 19（11）：4210-4220.

[13]Grotendorst GR， Duncan MR. Individual domains of connective tissue growth factor regulate fibroblast proliferation and myofibroblast differentiation[J].Faseb J，2005， 19（3）：729-738.

[收稿日期]2012-04-04 [修回日期]2012-06-28

编辑/张惠娟