猪肝脏总RＮA快速提取方法

摘要：采用ＣＴＡＢ法和改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取贵州从江香猪（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）新鲜肝脏的总ＲＮＡ，通过紫外分光光度法和凝胶电泳检测ＲＮＡ质量。结果表明，改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取的总ＲＮＡ的纯度高，完整性好，优于ＣＴＡＢ法。且改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取的猪肝脏总ＲＮＡ可用于ＲＴ－ＰＣＲ等后续分子生物学操作。

关键词：ＲＮＡ提取；猪（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）；肝脏；ＣＴＡＢ法；Ｔｒｉｚｏｌ法

中图分类号：Ｑ５９３＋．１；Ｑ５２２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）03－0621-02

Ｆａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ Ｌｉｖｅｒ

ＹＵ Ｘｉａｏ－ｄａｎ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｆｒｅｓｈ ｌｉｖｅｒ ｏｆ Ｃｏｎｇｊｉａｎｇ Ｘｉａｎｇ－ｐｉｇ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ） ｉｎ Ｇｕｉｚｈｏｕ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｒ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｔｈａｎ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｗａｓ ａｌｓｏ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｓｕｃｈ ａｓ ＲＴ－ＰＣＲ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｐｉｇ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）； ｌｉｖｅｒ； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； Ｔｒｉｚｏｌ ｍｅｔｈｏｄ

分离出纯净完整的ＲＮＡ是进行基因表达分析及ＲＮＡ功能研究的基础，在ＲＮＡ实验中，最关键的因素是分离得到全长ＲＮＡ［１］。目前提取动物组织总ＲＮＡ的方法很多，应用较多的有苯酚法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ－酚抽提法等，由于ＲＮＡ极不稳定，易被降解，ＲＮＡ酶无处不在，获得高纯度且完整的ＲＮＡ并不容易。尤其对于代谢旺盛的组织，如肝脏、心脏等的总ＲＮＡ的提取，一些方法尚有不尽如人意之处，如试剂盒法提取的成本高，ＲＮＡ产量较低，不利于后续分子生物学分析等。因此，ＲＮＡ的提取方法需要不断摸索和改进［２－４］。本实验以贵州从江香猪（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）新鲜肝脏组织为材料，采用ＣＴＡＢ法和改良的Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，以为后续相关分子生物学操作奠定基础。

１材料与方法

１．１材料与试剂

取现宰新鲜从江香猪肝脏，－８０ ℃保存备用。实验仪器包括研钵、低温高速离心机、水浴锅、紫外分光光度计等。所用试剂有ＭＯＰＳ、０．１％ ＤＥＰＣ水、Ｔｒｉｚｏｌ、ＣＴＡＢ提取缓冲液、水饱和酚、液氮等。

１．２实验方法

１．２．１Ｔｒｉｚｏｌ法①取香猪新鲜肝脏组织０．１ ｇ置于研钵中，加入液氮快速研磨，然后加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ试剂，溶化后加至２．０ ｍＬ离心管中。②加入０．５ ｍＬ体积比为１∶１的氯仿－水饱和酚，上下颠倒混匀，静置几分钟，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ。③吸取上层水相至另一离心管中，加入０．５ ｍＬ预冷的异丙醇混匀，室温放置１０ ｍｉｎ，４ ℃、１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清。④加入１ ｍＬ 体积分数７５％的乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀，重复２次，４ ℃、７ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，超净工作台吹干，溶于３０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水，－８０ ℃储存。

１．２．２ＣＴＡＢ法在李菁芳等［４］和左欣欣等［５］报道的ＣＴＡＢ法的基础上进行，步骤如下：①在２ ｍＬ的离心管加入０．５ ｍＬ ＣＴＡＢ提取缓冲液、１０ μＬ β－巯基乙醇于６５ ℃预热。②取０．１ ｇ猪肝脏，加入液氮迅速研磨成粉末，将粉末状样品转移至预热好的装有ＣＴＡＢ提取缓冲液的离心管中，混合均匀。③６５ ℃水浴加热１０ ｍｉｎ，期间每隔２ ｍｉｎ轻轻地摇匀。④向混合物中加入１００ μＬ ２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＡｃ（ｐＨ ４．０）和０．５ ｍＬ水饱和酚轻轻混匀，再加入１００ μＬ体积比为２４∶１的氯仿－异戊醇混匀，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。⑤小心移取上清液到一个新的２ ｍＬ的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇混匀，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清液。⑥加入１ ｍＬ ７５％的乙醇漂洗，７ ５００ ｒ／ｍｉｎ离心洗涤５ ｍｉｎ，弃乙醇，倒立离心管于超净工作台上使沉淀干燥，加入３０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水，－８０ ℃储存。

１．２．３总ＲＮＡ纯度和完整性检测取５ μＬ制备的ＲＮＡ样品用ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水稀释到２００ μＬ，用７５２型紫外分光光度计分别测定样品在２６０、２８０ ｎｍ波长下的吸光度，判断其纯度。用１．２％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测所提ＲＮＡ的完整性。

１．２．４ＲＴ－ＰＣＲ检测ＲＮＡ反转录合成ｃＤＮＡ链后，选用猪持家基因β－ａｃｔｉｎ的特异性引物对其进行检测，引物序列为：正向引物５′－ＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴ

ＣＡＣＣＡＣＣＡＣ－３′，反向引物５′－ＴＡＣ ＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣ

ＴＧＡＴＣ－３′。ＰＣＲ反应体系为２５ μＬ：反转录ｃＤＮＡ模板１ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．５ μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５ μＬ，引物各１ μＬ（１０ μｍ／Ｌ），Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １６ μＬ。ＰＣＲ扩增在ＰＴＣ－２００型扩增仪（Ｂｉｏ－ＲＡＤ）上完成，反应程序为：９４ ℃，５ ｍｉｎ；９４ ℃，３０ ｓ，５７ ℃，４５ ｓ，７２ ℃，１ ｍｉｎ，３０个循环；７２ ℃延伸５ ｍｉｎ，于４ ℃下保存。产物进行１．２％琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统拍照分析。

２结果与分析

２．１总ＲＮＡ纯度和完整性

采用改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的ＲＮＡ样品稀释后，经紫外分光光度检测，ＯＤ２６０ ｎｍ / ＯＤ２８０ ｎｍ均在１．８５～２．２０之间，表明所提取的ＲＮＡ样品中所含的蛋白质等杂质少，纯度较高。ＣＴＡＢ法提取的样本ＯＤ２６０ ｎｍ / ＯＤ２８０ ｎｍ在１．８左右，纯度稍低。

用１．２％的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进一步检测所提取的总ＲＮＡ的质量，结果如图１所示，改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的总ＲＮＡ纯度高、完整性较好、２８ Ｓ和１８ Ｓ ｒＲＮＡ电泳条带清晰，基本无拖带现象，且２８ Ｓ ｒＲＮＡ的亮度约是１８ Ｓ ｒＲＮＡ的２倍，说明提取的ＲＮＡ完整性好，无蛋白质等污染，为后续的分子生物学分析奠定了良好的基础。ＣＴＡＢ法提取得到的样品条带较模糊，拖尾较严重。

２．２ＲＴ－ＰＣＲ检测结果

对采用改良的Ｔｒｉｚｏｌ法所提取的猪肝脏组织总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，由图２可以看出，目的条带清晰、位置正确（约５００ ｂｐ），说明改良Ｔｒｉｚｏｌ法所提取ＲＮＡ的质量和完整性都较高，可以满足后续分子生物学实验的要求。综合分析凝胶电泳和ＲＴ－ＰＣＲ检测结果可知，改良Ｔｒｉｚｏｌ法适用于猪肝脏组织总ＲＮＡ的提取。

３讨论

脏器代谢旺盛，相对于其他组织而言，一方面其基因表达丰度和蛋白含量较高；另一方面各种酶，包括核糖核酸酶的活性也高。因此有效地抑制核糖核酸酶活性和去除蛋白质的污染是获得高质量脏器ＲＮＡ的关键［６］。本实验使用液氮迅速处理新鲜的猪肝脏组织，以抑制内源ＲＮＡ酶的活力；同时，还用ＤＥＰＣ溶液对实验所用物品进行了处理，使用ＲＮＡ专用仪器设备，操作过程中使用一次性ＰＥ手套和口罩等，以避免外源ＲＮＡ酶的污染，从而保证了总ＲＮＡ的完整性。

本研究采用Ｔｒｉｚｏｌ和ＣＴＡＢ法从贵州从江香猪肝脏提取总ＲＮＡ，两种方法都能获得总ＲＮＡ，但总ＲＮＡ的质量有明显差异。比较而言，ＣＴＡＢ法药品配制繁琐，实验的操作时间长且提取效果不很理想。Ｔｒｉｚｏｌ提取试剂由酚与异硫氰酸胍组成，所需试剂较简单，提取过程快速，总ＲＮＡ质量也较高，适用于后续分子生物学操作。

参考文献：

［１］ 吕娜，张玲，刘宁．提取血液总ＲＮＡ两种方法的比较和分析［Ｊ］． 东北农业大学学报，２００８，３９（８）：１１０－１１２．

［２］ 王桂玲，刘戈飞，黄东阳． 从动物组织提取高质量总ＲＮＡ方法的改进［Ｊ］． 生物技术通讯，２００４，１４（６）：５１２－５１４．

［３］ 马倩，张永宏，秦莹，等． 松辽黑猪脏器总ＲＮＡ提取方法的改进及应用［Ｊ］． 安徽农业科学，２００９，３７（１２）：５３８４－５３８５．

［４］ 李菁芳，黄劭毅，田仁鹏，等． 一种适用于ＲＴ—ＰＣＲ的杉树类植物中总ＲＮＡ提取的方法［Ｊ］． 武汉植物学研究，２００４，２２（６）：５５１－５５６．

［５］ 左欣欣，陈泽宇，马腾，等． 从动物组织中提取总ＲＮＡ的ＣＴＡＢ法［Ｊ］． 中国西部科技，２０１１，１０（２）：３５－３６．

［６］ 付月君，张志云，柴宝峰，等． 从棉铃虫体中提取总ＲＮＡ的一种有效方法［Ｊ］． 生物技术通报，２００４（５）：４０－４２．

（责任编辑向闱）

收稿时间：２０１１－０８－１１

基金项目：遵义师范学院生物学重点学科支持项目；遵义师范学院遵义区域经济研究中心项目（ＺＥ２０１０１１）

作者简介：喻晓丹（１９６２－），女，副教授，主要从事动物解剖、动物生理研究工作，（电话）１３５９５２４７６４０（电子信箱）ｙｕｘｉａｏｄａｎｓｈｅｎｇｗｕｘｉ＠１６３．ｃｏｍ。