玉竹对UVB诱导HaCaT细胞损伤的保护作用

王业秋,陈巧云,张宁,井丽巍,祁永华

[摘要]目的：探讨玉竹水提液对中波紫外线（UVB）诱导人皮肤角质形成细胞损伤的保护作用及其可能机制。方法：用64mJ·cm-2的UVB照射人皮肤角质形成细胞建立光老化细胞模型，以不同浓度玉竹提取物处理光老化细胞，羟胺法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法检测丙二醛（MDA）含量，酶联免疫法检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）分泌量。结果：UVB照射角质形成细胞后，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，TNF-α、IL-6分泌量增加（P<0.01），玉竹水提液中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）剂量组能显著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，减少TNF-α、IL-6分泌（P<0.05或P<0.01）。结论：玉竹水提液可在一定程度上减轻UVB对角质形成细胞的损伤，其机制可能与其抑制氧化损伤，增强细胞抗氧化能力，减少炎症细胞因子分泌有关。

[关键词]玉竹；UVB；HaCaT细胞；保护作用

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）04-0599-03

Protective effects of yuzhu on hacat cells damaged by ultraviolet B

WANG Ye-qiu,CHEN Qiao-yun,ZHANG Ning,JING Li-wei,QI Yong-hua

(Institute of Traditional Chinese Medicine &Cosmetology,Faculty of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine, Jiamusi 154007,Helongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of water-extract solution of Yuzhu on HaCaT cells injured by irradiation of ultraviolet B and its possible mechanisms.MethodsCell photoaging model was established by irradiating HaCaT cells with UVB(64mJ·cm-2). HaCaT cells were treated with different concentration water-extract solution of Yuzhu. The activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px),the content of malondialdehyde(MDA) were detected by biochemical assay, the secretion levels of TNF-α and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe proliferation activity of HaCaT cells descended with the UVB irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA, TNF-α, IL-6, were ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg·ml-1) and high concentration(200μg·ml-1) of water-extract solution of Yuzhu, the above changes induced by UVB irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution of Yuzhu might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVB. And its mechanism may have relationship with the ability of strengthening antioxidation, decreasing oxygen radicals and decreasing the secretions of proinflammatory cytokines.

Key words:Yuzhu;UVB;HaCaT cells;protective effects

随着环境污染的日益严重，到达地球表面的UV日益增多，UV辐射对健康的危害已成为全球关注的重大环境与健康问题之一，有关UV辐射的机制和防治研究是目前的研究热点。中药以其独特的优势，在抗皮肤光损伤领域的研究工作得到广泛开展，玉竹为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce的干燥根茎，现代药理学研究表明玉竹具有抗氧化、清除自由基、提高免疫力、抗肿瘤等多种生物活性[1-3]。笔者以体外培养的人皮肤角质形成细胞（HaCaT）为研究对象，在体外成功建立UVB诱导HaCaT细胞光损伤模型，观察玉竹水提液对UVB损伤HaCaT细胞的保护作用。

1材料和仪器

1.1 实验材料：人皮肤角质形成细胞HaCaT（武汉大学细胞中心），MEM培养基（Gibco公司），胎牛血清、胰蛋白酶、双抗（Billab公司），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程公司），TNF-α、IL-6（研域(上海)化学试剂有限公司），中药玉竹（北京同仁堂制药集团哈尔滨分店，经本校陈效忠副教授鉴定为正品）。

1.2 仪器：紫外照射仪（Sigma公司），紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂），Resecarch UV UF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），IX-71-21PH型Olympus倒置显微镜（日本 Olympus株式会社），HF90型二氧化碳培养箱（上海智城分析仪器有限公司），MK3酶标仪（美国热电公司），MS-500A半自动生化分析仪(美生科技有限公司)，MODUL YOD-230冷冻干燥仪（美国热电公司）。

2实验方法

2.1 药物的配置：取玉竹100g加1000ml蒸馏水加热煮沸1h，减压抽滤后，滤渣加1000ml水提取两次，合并三次滤液，浓缩成浸膏，经冷冻干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中备用。实验时取玉竹冻干粉用MEM培养液配成所需浓度，调pH值为7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

2.2 HaCaT的培养：HaCaT细胞在含有10%胎牛血清的MEM培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。取对数生长期的细胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，调整其密度为5×105个·ml-1，定量接种于12孔板。

2.3 细胞光老化模型的建立：参照文献[4-5]的方法，将处于对数生长期的细胞接种于12孔板，待细胞单层贴壁后，弃培养液，每孔加入1ml PBS，使用64mJ·cm-2的UVB照射，空白组用铝箔盖住。

2.4 实验分组：预实验时设置50μg·ml-1、100μg·ml-1、150μg·ml-1、200μg·ml-1、250μg·ml-1、300μg·ml-1 6个剂量组做玉竹对正常HaCaT细胞的毒性作用实验，发现250μg·ml-1、300μg·ml-1对HaCaT细胞有明显毒性作用，因此正式实验确定的玉竹最高剂量组为200μg·ml-1。

将处于对数生长期的细胞接种于12孔板，随机分为空白组、模型组、玉竹水提液低（50μg·ml-1）、中（100μg·ml-1）、高（200μg·ml-1）剂量组。接种24h后各组弃培养液，每孔加入1ml PBS，除空白对照组外，按照2.3的方式造模。照射后弃去PBS，加入含药的MEM培养基继续培养。以上各组细胞每组设6个复孔。

2.5 检测细胞中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：给药24h后收集各组细胞，用冷PBS清洗2次，超声破碎细胞，严格按照试剂盒说明书操作，检测SOD活性，GSH-Px活性和MDA含量。

2.6 ELISA方法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6：给药24h后收集各组细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作说明书检测肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-6的分泌量。

2.7 统计学方法：用SPSS13.0软件对结果进行统计分析，多样本间的方差分析采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1 玉竹水提液对HaCaT细胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影响：见表1。由表1得，与空白对照相比，模型对照组的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型对照组相比较，玉竹水提液各剂量组均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且玉竹水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

3.2 玉竹水提液对HaCaT细胞分泌TNF-α、IL-6的影响：见表2。由表2得，与模型对照组相比较，玉竹水提液各剂量组均能降低TNF-α与IL-6分泌量；且玉竹水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

4讨论

4.1 紫外线辐射是皮肤物理性损伤的主要因素，长期的紫外线辐射最终可导致光老化和皮肤肿瘤。波长短能量较高的UVB（290～320nm）主要作用于表皮，角质形成细胞是其靶细胞，UVB可以使角质形成细胞产生大量ROS，诱发氧化反应，引起一系列的氧化性损伤[6]，导致超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶含量下降，非酶自由基清除剂耗竭，过氧化最终产物丙二醛（MDA）等大量积累，而损伤的皮肤抗氧化防御体系会导致更多ROS的产生，以正反馈形式加剧皮肤组织和细胞的损伤。另外角质形成细胞在UVB辐射后可释放多种介导炎症反应、调节免疫应答和诱导细胞凋亡等生物学作用的细胞因子[7-9]。其中TNF-α是细胞因子网络中心之一，可导致多种细胞因子的释放，进而引起细胞凋亡，IL-6是角质形成细胞-成纤维细胞相互作用环路中的重要中介物质，其主要免疫学功能是加强其它细胞因子的效果。

中草药对皮肤的光保护作用日益受到临床的重视和应用[10]。传统中药玉竹用于抗衰老的历史源远流长，早在《神农本草经》就将其奉为上品，谓“久服，去面黑，好颜色润泽，轻身不老”。现代药理研究表明玉竹能抗氧化，清除自由基、抗炎等多种生物活性及药理作用，说明玉竹具有抗皮肤光损伤的潜力，笔者的前期实验证实玉竹对人皮肤真皮层的成纤维细胞具有很好的光保护作用[11]，本文从人表皮层角质形成细胞的抗氧化系统和细胞因子分泌来探讨玉竹抗皮肤损伤的作用机理。

4.2 实验结果表明，玉竹水提液低剂量组（50μg·ml-1）保护角质形成细胞免受UVB损伤的作用效果不明显；中（100μg·ml-1）、高剂量组（200μg·ml-1）均能显著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，有效地对抗UVB对角质形成细胞氧化性损伤。同时玉竹水提液中高剂量组可以抑制UVB引起的TNF-α和IL-6的分泌来减轻紫外线引起的皮肤光老化及炎症反应的发生。

综上，玉竹可以通过多种途径抑制紫外线对皮肤的损伤。本研究对防护紫外线产品的开发具有参考价值，可以为寻求天然防晒剂提供理论依据。

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[收稿日期]2011-11-22[修回日期]2012-02-10

编辑/张惠娟