土壤磷酸酶测定中不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响

夏栋,许文年,赵自超,赵娟,祝顺波

摘要：确定了土壤磷酸酶测定时最大吸收波长以及显色时应加入的最佳ｐＨ缓冲溶液。研究结果表明，加入ｐＨ为８．０~１０．０的缓冲液时显色时间快，在可见光区的最大吸收峰在６０４ ｎｍ处，其中以ｐＨ ９．０的吸光度最高，摩尔吸光系数为１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），灵敏度较高。因此确定加入的最佳缓冲溶液ｐＨ为９．０，同时选择６０４ ｎｍ作为最大吸收波长。

关键词：土壤磷酸酶；缓冲溶液；吸收波长；ｐＨ；测定

中图分类号：Ｏ６５７．３２；Ｓ１５１．９文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－0997-02

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Dｉｆｆｅｒｅｎｔ Bｕｆｆｅｒ Sｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Aｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Wａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｉｎ Dｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ

Sｏｉｌ Pｈｏｓｐｈａｔａｓｅ

ＸＩＡ Ｄｏｎｇ，ＸＵ Ｗｅｎ－ｎｉａｎ，ＺＨＡＯ Ｚｉ－ｃｈａｏ，ＺＨＡＯ Ｊｕａｎ，ＺＨＵ Ｓｈｕｎ－ｂｏ

（Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，

Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Tｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｈａd ｂｅｅｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８．０～１０．０ ｃｏｌｏｒｅｄ ｆａｓｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ was ６０４ ｎｍ． Ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｄｄｅｄ ｔｈｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ＝９．０） ｗａｓ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ １．７１７ × １０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）． Ｔｈｅ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐＨ ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ９．０， ａｎｄ ６０４ ｎｍ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： sｏｉｌ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ； bｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ； aｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ； ｐＨ； dｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ

土壤磷酸酶是一类催化土壤有机磷化合物矿化的酶，其活性高低直接影响着土壤中有机磷的分解转化及其生物有效性，可作为反映土壤磷素水平的一项生物指标［１］。目前常用的测定方法为有机基团含量法［２］，但测定时波长的选择上却不一致，分别有５７８ ｎｍ［３，４］、６００ ｎｍ［５］、６６０ ｎｍ［２，６］。同时在吸取土壤滤液进行显色时，加入一定体积的缓冲溶液的ｐＨ值也不统一，有９．０［４］、９．４［２］、９．６［３］。根据这些情况，本研究对土壤磷酸酶测定时不同缓冲溶液对显色液吸收波长的影响进行了研究，并在波长与缓冲溶液的选择中得到最优结果。

１实验部分

１．１仪器与试剂

１．１．１仪器Ｕ－３０１０紫外－可见分光光度计（日本日立）；１ ｃｍ石英比色皿；５０ ｍＬ容量瓶。

１．１．２试剂酚工作液：１ ｇ重蒸酚溶于蒸馏水中，稀释至１ Ｌ，贮于棕色瓶中，取１０ ｍＬ 酚溶液稀释至１ Ｌ（每毫升含０．０１ ｍｇ苯酚）即为酚工作液；氯代二溴对苯醌亚胺试剂：０．２ ｇ氯代二溴对苯醌亚胺溶于１００ ｍＬ无水乙醇中；系列缓冲溶液的配制：ｐＨ ５．０～５．８采用乙酸－乙酸钠缓冲溶液配制，ｐＨ ６．０～７．８采用磷酸盐－柠檬酸盐缓冲溶液配制。ｐＨ ８．０～９．０采用硼酸－硼酸盐缓冲溶液配制，ｐＨ ９．２～１０．０采用硼砂－氢氧化钠缓冲溶液配制。配制方法见文献［２］。

１．２实验方法

吸取１０ ｍＬ酚工作液（０．０１ ｍｇ／ｍＬ）于５０ ｍＬ容量瓶中，分别加入５ ｍＬ上述配制的不同缓冲液，摇匀后加入６滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，３０ ｍｉｎ后用１ ｃｍ 石英比色皿，以试剂空白作参比，在Ｕ－３０１０紫外－可见分光光度计上进行波长扫描，并绘制吸光度随波长变化曲线。确定最大吸收波长后，在该波长下进行显色液吸光度随时间变化的试验。

２结果与分析

２．１不同缓冲溶液下显色时间

不同缓冲溶液下显色液开始显色时间见表１。从表１可以看出，加入ｐＨ低于８．０（ｐＨ ５．０～７．8）的缓冲溶液的显色液显色时间缓慢，甚至不显色，而ｐＨ高于８．０的则显色较快。同时在试验过程中观察发现，显色缓慢的显色液的颜色很浅。

２．２不同缓冲溶液下显色液波长扫描与最大吸收波长

对显色较慢的未进行波长扫描，ｐＨ ８．０～１０．０的不同缓冲溶液下显色液波长扫描曲线见图１，最大吸收波长值见表２。通过图１、表２可以看出，显色液在紫外区与可见光区均有最大吸收峰。不同缓冲溶液下显色液在紫外区的最大吸收波长不一致，在２６８～３１０ ｎｍ之间出现波动变化，而在可见光区最大吸收波长则较一致，除ｐＨ ８．６与９．６ 为６０５ ｎｍ外，其余缓冲体系下最大吸收波长均为６０４ ｎｍ。

２．３不同缓冲溶液下显色液吸光度随时间的变化

通过图２可以看出，不同缓冲溶液下吸光度随显色时间的延长表现出不同变化，ｐＨ ８．０、８．２、８．４、８．６缓冲溶液下显色液吸光度随时间的延长出现持续上升的趋势，其他ｐＨ条件下则表现为３０ ｍｉｎ后溶液吸光度呈现稳定的状态。就实验的结果来看，２ h内在ｐＨ ９．０～１０．０下的显色液中形成的配合物稳定。在显色３０ ｍｉｎ后稳定的显色液中，从图中可以看出，ｐＨ ９．０的吸光度最高，在０．３６５附近，其摩尔吸收系数为１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），灵敏度较高。其次为ｐＨ ９．４和９．２，二者摩尔吸收系数分别为１．２９９×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）、１．２３３×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ）。缓冲液ｐＨ ９．８的吸光度最低，其次为ｐＨ １０．０。

３小结与讨论

通过本试验研究表明，不同缓冲溶液对土壤磷酸酶测定时显色液吸收波长有一定的影响。ｐＨ值低于８．０的缓冲液不利于溶液的显色，显色时间缓慢，ｐＨ ８．０～１０．０的显色时间快，在紫外区与可见光区分别有最大吸收峰，但紫外区的吸收波长彼此不一致，可见光区的则在６０４ ｎｍ处。不同缓冲溶液下显色液吸光度随显色时间的变化则表明，在ｐＨ ９．０～１０．０下的显色液中形成的配合物稳定，其中以ｐＨ ９．０的吸光度最高，其摩尔吸光系数为１．７１７×１０４ Ｌ／（ｍｏｌ·ｃｍ），灵敏度较高。

根据以上结论，结合实验操作的实际情况，建议在土壤磷酸酶测定过程中，吸取土壤滤液显色时，加一定体积的缓冲溶液的ｐＨ选择９．０，同时选择６０４ ｎｍ波长的光作为光源。

参考文献：

［１］ 于群英． 土壤磷酸酶活性及其影响因素研究［Ｊ］． 安徽技术师范学院学报，２００１，１５（４）：５－８．

［２］ 关松荫． 土壤酶及其研究法［Ｍ］． 北京： 农业出版社，１９８７．

［３］ 李振高，骆永明，滕应． 土壤与环境微生物研究法［Ｍ］． 北京：科学出版社，２００８．

［４］ 林先贵． 土壤微生物研究原理与方法［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，２０１０．

［５］ 章家恩． 生态学常用实验研究方法与技术［Ｍ］． 北京：化学工业出版社，２００７．

［６］ 沈桂琴． 土壤中磷酸酶活性的测定方法［Ｊ］．土壤肥料，１９８７（１）：４０－４２．