酶联免疫吸附试验法检测基础免疫儿童破伤风抗体水平

罗 君，朱路平，李东丽

破伤风是由破伤风杆菌 (clostridium tetani)侵入伤口生长繁殖产生毒素而引起的一种急性特异性感染。破伤风可在任何年龄发病，病死率高。为了解0～7岁儿童破伤风疫苗全程足量免疫后抗体水平，本研究收集了郑州市262份0～7岁基础免疫儿童血清样品，用国内和国外两种酶联免疫吸附试验 (ELISA)试剂盒进行破伤风IgG抗体定量检测，并且评价破伤风IgG ELISA试剂的检测效率和可靠性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2010年8月—2011年3月郑州大学第三附属医院0～7岁基础免疫儿童血清样本262份，其中男140份，女122份。检测前所有标本－20℃保存。

1.2 样本采集

1.2.1 免疫程序 根据我国2005年《预防接种工作规范》中规定［1］，百白破疫苗为国家免疫规划中基础免疫疫苗，常规免疫程序为百白破疫苗接种5剂次，前3剂次为基础免疫，第4剂次为加强免疫，第5剂次使用疫苗加强免疫1剂次。新生儿出生后3个月开始接种百白破疫苗第1针，连续接种3针，每针间隔时间最短不得少于28 d，在1岁半至2周岁时再用百白破疫苗加强免疫1针，7周岁时用精制白喉疫苗或精制白破二联疫苗加强免疫1针。

1.2.2 样本采集 262份血清样本抽样采集于郑州大学第三附属医院的基础免疫儿童，包括未接种疫苗的新生儿样本，及接种疫苗后不同年龄段样本，抽取的样本待自然凝固后高速离心，取上层血清于1.5 ml试管中冷冻备检，并编号。

1.3 检测试剂 使用两种检测试剂盒，分别是郑州市安图绿科生物工程有限公司生产的破伤风毒素IgG抗体定量检测试剂盒 (批号:20101001，简称“安图试剂”)和德国MPBiomedicals Germany GmbH生产的获得CE注册的破伤风类毒素IgG抗体检测试剂盒 (批号:TT－204，简称“MP试剂”)。

1.4 检测方法 ELISA间接法检测。将血清1∶100稀释后加入包被有破伤风类毒素的96孔酶标反应板，按照操作程序显色后450 nm下读取吸光度 (A)值。使用定量试剂盒提供的含量为0.1、0.2、0.4、0.8和2.0 U/ml的标准血清绘制标准曲线或计算标准回归方程，根据样品A值计算出IgG抗体含量(U/ml);同时以0.1 U/ml标准血清对应的A值为临界值(Cutoff)，确定IgG抗体的阴性或阳性。262份儿童血清样本用两种试剂盒进行平行检测，试验中加样试剂和洗板步骤分别由固定2人分工完成，试验过程严格按试剂盒推荐步骤操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计学软件进行统计分析，计数资料的比较采用χ2检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基础免疫儿童血清破伤风IgG抗体水平 262份样本中，“MP试剂”检出结果IgG抗体阳性154份，阳性率为58.78%;“安图试剂”检出结果IgG抗体阳性146份，阳性率为55.73%。两种试剂盒的检测阳性率比较差异无统计学意义 (χ2=1.45，P=0.227，见表1)。

表1 儿童血清破伤风IgG抗体水平Table 1 Tetanus antibodies level of children with fundamental immunity

2.2 不同年龄段儿童血清破伤风IgG抗体水平 两种试剂盒检测的不同年龄段儿童血清破伤风IgG抗体水平比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。且不同年龄段的基础免疫儿童的破伤风保护率达到了《计划免疫管理规程》的相关规定。

3 讨论

破伤风是危险性很高的感染性疾病，人体内破伤风IgG抗体的存在主要有两个来源:一是新生儿由母亲体内传递来的或普通人群通过被动免疫获得，二是注射免疫后获得。接种破伤风疫苗是有效的预防手段，因此，我国一直把百白破疫苗列为基础免疫疫苗，常规免疫程序为5剂次，首针接种时间为出生后3个月的婴儿。了解人群特别是基础免疫儿童的破伤风保护抗体水平很有必要。

ELISA法检测因其具有快速、敏感、特异、简便、结果容易判定等特点，最近几年被广泛用于人血清中细菌抗体水平的检测。有实验表明，ELISA法检测血清破伤风IgG抗体的灵敏度可达到0.004 U/ml［2］。采用间接 ELISA 法检测百日咳、白喉和破伤风抗体，在敏感性、快速性和结果客观性及可操作性等方面均优于间接血凝法，是代替传统的小鼠中和试验法的有效办法。

不同地区、不同种族的人群机体中破伤风IgG抗体与试剂盒的反应性强弱存在差异，各实验室应根据自己实际条件及接触人群建立正常参考值。世界卫生组织(WHO)认为，ELISA法检测时，血清中的中和抗体≥0.1 U/ml才被认为是阳性，该标准为人破伤风抗毒素血浆的筛查工作，和百白破疫苗全程免疫后人体破伤风抗毒素水平的检测提供了重要参考依据。

表2 基础免疫不同年龄段儿童血清破伤风IgG抗体水平Table 2 Tetanus antibodies level in different age children with fundamental immunity

本次抽样采集的262份0～7岁基础免疫儿童血清样品，分别用“安图试剂盒”和“MP试剂盒”检测破伤风IgG抗体，在实验结果判定时，依据国际标准，确定0.1 U/ml作为破伤风抗体最低保护浓度。检测结果抗体阳性率分别为55.73%和58.78% ，两种试剂盒检测结果无差异。有资料报道，1～14岁儿童破伤风IgG抗体达到保护水平 (≥0.1 U/ml)的比例可达到94.55%［3］，而本研究结果显示郑州市0～7岁基础免疫儿童破伤风IgG抗体保护率仅达到55%左右，此结果提示今后加强儿童百白破三联疫苗注射的必要性。

根据卫生部《计划免疫管理规程》要求，新生儿出生后3个足月开始接种百白破疫苗第1针，说明该人群为破伤风易感人群。此次的检测结果均显示，＜3个月新生儿破伤风的保护率在30%以内，这与文献报道“新生儿出生时具有与母亲相同或稍高的破伤风抗体的滴度，从而可使新生儿短暂获得对破伤风的被动免疫保护”相符［4］;同时，检测结果也反映出儿童在未免疫的低月龄 (1～2个月)内最易发病的实际情况。有关文献建议将免疫程序中的百白破疫苗初免月龄由3个月龄提前到2个月龄，与国际上许多国家一致［5］。

检测结果中39名3个月龄儿童的破伤风抗体保护率仅为15%左右，提示3个月左右未接种破伤风疫苗的婴儿自身抗体水平较低，体内并不存在来自于母体的抗百日咳、抗白喉、抗破伤风的三种特异抗体，完全不足以抵抗三种疾病的侵袭，使得未免疫婴儿3个月龄内患百日咳、白喉、破伤风的危险性增加。

本研究中，34名4～6个月新生儿，均为破伤风疫苗连续接种3针，完成了百白破疫苗的基础免疫。检测结果显示，破伤风抗体保护率达到82.29%，达到了《计划免疫管理规程》规定的＞75.0%的要求;54名6～18个月儿童的破伤风的保护率也达到80%以上，与4～6个月的新生儿相比，破伤风抗体浓度基本持平。《计划免疫管理规程》规定，新生儿在1岁半至2周岁时再用百白破疫苗加强免疫1针，6周岁时用精制白喉疫苗或精制白破二联疫苗加强免疫1针。本研究结果显示，＞1.5岁的新生儿，破伤风的保护率均为85%左右，与6～18个月儿童相比，破伤风保护率又有所提高，达到了《计划免疫管理规程》规定的＞75.0%的要求。

本研究结果提示，本地区0～7岁基础免疫儿童血清破伤风IgG抗体保护率较低，加强人群破伤风类毒素免疫很有必要。3个足月的新生儿应及时按照规范要求，全程接种百白破疫苗，并按照规定接种加强针，以维持体内足够的抗体水平。

1 卫生部.预防接种工作规范［R］.卫疾控发〔2005〕373号.

2 郭立君，邵华，杨丽华，等.破伤风抗体IgG酶联检测试剂盒的研制 ［J］.中国生物制品学杂志，2003，16(4):225－226.

3 沈月根，姜霞玲，顾谢君.嘉兴市秀洲区健康人群百日咳、白喉、破伤风抗体水平监测 ［J］.中国计划免疫，2004，10(1):37.

4 孙月平.对育龄妇女破伤风免疫状况的分析［J］.细胞与分子免疫学杂志，2007，23(2):175.

5 侯启明.不同区域婴儿抗百日咳、白喉、破伤风母体抗体水平的调查 ［J］.中国计划免疫，2006，12(3):209－211.