香菇多糖抑菌作用的研究

孟俊龙，冯翠萍，常明昌，程红艳

（1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 资源与环境学院，山西 太谷030801）

香菇［Lentinus edodes（Berk.）Sing］在分类学上隶属于担子菌纲伞菌目侧耳科香菇属，是世界著名的食用兼药用菌之一，香菇中含有一种分子量为100万的香菇多糖［1］。近年来的研究发现，香菇中的香菇多糖能治疗癌病，能够刺激机体的免疫系统使机体的免疫功能得到恢复和提高，由机体本身的抵抗力去杀死肿瘤细胞；香菇多糖还可改善肌体代谢，增强机体对多种细菌、寄生虫、病毒性感染（包括艾滋病）的免疫能力；香菇多糖及其培养液还有护肝并增强肝排毒能力，降低血清转氨酶水平的作用；香菇多糖能提高SOD活性和降低脂褐素含量；香菇多糖有抑制血小板聚集作用，还有一定的抗疲劳作用［2～5］。

本试验用分光光度法来探讨香菇多糖对大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmonella）的抑制作用，旨在为真菌多糖的抑菌性研究提供思路和方法，同时也为香菇多糖作为抑菌成分的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

香菇多糖参照文献［6］水提醇沉法提取，葡聚糖G－100纯化。

1.1.2 供试菌种

大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、沙门氏菌（Salmomella）均由山西农业大学食品质量与安全实验室提供。

1.1.3 试剂

乙醇、无水乙醚、丙酮、柠檬酸、氯化钠、氢氧化钠、营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器设备

电热恒温水浴锅（北京玻联医疗器械有限公司）、离心机（上海安享科学仪器厂）、2100型分光光度计（UNICO）、隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械处）、全温震荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海新高医疗器械制造有限公司）、超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备处）、高压灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备处）、旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 固体培养基的配制

称取4.5g营养琼脂加入到100mL蒸馏水中，在三角瓶中加热待完全融化后，121℃，15min高压灭菌，备用。

1.2.2 液体培养基的配制

称取牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g加入到100mL蒸馏水中，加热待完全溶解后，调pH于7.2，分装于三角瓶中，121℃，15min高压灭菌，备用。

1.2.3 无菌生理盐水的配制

准确称取9g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃，15min高压灭菌，备用。

1.2.4 菌悬液的制备

在无菌条件下，用接种环挑取固体培养基上1～2个大小适宜的菌落于液体培养基中，37℃摇床培养24h即可得一定浓度的菌悬液，用无菌生理盐水稀释菌悬液，使其吸光值分布在0.6～0.8之间，置4℃冰箱中保存备用。

1.2.5 香菇多糖对四种菌的抑制作用

1.2.5.1 不同时间香菇多糖对四种菌的抑制作用的影响

在无菌条件下，分别取上述菌悬液9mL，并添加1g·L－1的香菇多糖液200μL，用旋涡混匀器混匀后，在37.5℃摇床培养，并以不加香菇多糖液的作为对照，以蒸馏水作为空白。每隔12h测定一次吸光度值A，共测定4次。重复3次，取平均值，计算其抑菌率，确定最适作用时间。

1.2.5.2 不同pH香菇多糖对四种菌的抑制作用的影响

在无菌条件下，分别取上述菌悬液9mL，并添加1g·L－1的香菇多糖液200μL，并用0.1mol·L－1柠檬酸和2.0%的NaOH溶液分别调整其pH为5、6、7、8、9，用旋涡混合器混匀后，在37.5℃摇床培养24h，以不加香菇多糖液的作为对照，以蒸馏水作为空白。测其吸光度值A，重复3次，取平均值，计算出抑菌率，确定最适作用的pH。

1.2.5.3 不同浓度香菇多糖对四种菌的抑制作用的影响

在上述最适条件下，用2倍稀释法将香菇多糖液的浓度稀释成1g·L－1，0.5g·L－1，0.25g·L－1，0.125g·L－1，0.0625g·L－15个浓度梯度。在无菌条件下，分别取上述菌悬液9mL，并添加不同浓度的香菇多糖液200μL，用旋涡混合器混匀，在37.5℃摇床培养24h，以不加香菇多糖液的作为对照，以蒸馏水作为空白。测其吸光度值，重复3次，取平均值，并计算出抑菌率［7］。

2 结果与分析

2.1 不同时间香菇多糖对四种菌抑制率的影响

由图1可见，时间对香菇多糖抑制4种菌有一定的影响。对沙门氏菌的抑制作用在24h时达到最大，对其它3种菌均在12h时达到最大。其中对金黄色葡萄球菌的抑制可达到100%。

2.2 不同pH值香菇多糖对四种菌抑制率的影响

由图2可见，不同的pH下，香菇多糖对4种菌的抑制作用不同。对金黄色葡萄球菌的抑制作用在pH为6时最大；对其它菌的抑制作用均在pH为5时最大。

图1 不同时间香菇多糖对四种菌抑菌率的影响Fig.1 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different time

图2 不同pH香菇多糖对四种菌抑菌率的影响Fig.2 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different pH

2.3 不同浓度香菇多糖对四种菌抑制率的影响

根据2.1和2.2确定的最佳抑菌条件进行不同浓度的香菇多糖对4种菌的抑菌作用的研究，结果见图3。随着浓度的降低，香菇多糖对4种菌的抑制率均逐渐减小，且香菇多糖对4种菌的抑制作用由强到弱依次为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌，当浓度达1g·L－1L时，抑制率分别达100%、100%、68.7%、44.1%。

3 讨论

3.1 分光光度法测定抑菌率

图3 不同浓度香菇多糖对四种菌抑菌率的影响Fig.3 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different concentration

分光光度法是测定抑菌作用常用的一种方法，该方法可避免牛津杯法在抑菌物浓度高时渗出效果差，以及纸片法吸收液体少等缺点。分光光度法测定抑菌率时由于菌悬液及多糖本身具有一定的吸光值，因此，在计算抑菌率时要消除菌悬液和多糖本身的吸光值。

3.2 时间对香菇多糖抑菌作用的影响

香菇多糖对4种供试菌种在12或24h达到最大抑菌作用，24h后香菇多糖的抑菌作用有所减弱，其原因可能是香菇多糖对细菌既有一定的抑制作用，也可为细菌的生长提供营养，这与细菌种类和数量有关，前期以抑制作用占主导，而24h后以作为营养物质供细菌生长为主导。

3.3 pH对香菇多糖抑菌作用的影响

香菇多糖对4种供试菌种都在酸性条件下达到最大抑菌作用，在碱性条件下抑制作用小。其结果可能由于酸性条件下有助于多糖液作用于细菌的细胞膜，破坏构成细胞壁的几丁质，破坏细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，导致菌体死亡［8］。细菌的最适生长pH 为6.5～7.5，在碱性条件时细菌生长速度快，碱性环境更适于细菌的生长繁殖，香菇多糖的浓度低对其的抑制作用小。

3.4 香菇多糖的抑菌作用

多糖对各类微生物的生长有程度不同的抑制活性，或者说生长拮抗，但多糖抑菌作用的机制还不十分明确［9］。本试验中香菇多糖的抑菌作用机制，可能是［10］：（1）一定浓度的多糖作用于细菌的细胞膜，破坏了细菌细胞膜的超分子结构而造成细胞内成分流失，导致菌体死亡。（2）由于微生物细胞壁上存在能与糖专一结合的糖基、蛋白，它能使多糖高度聚集于菌体的表面，改变菌细胞的代谢活动，最终导致细菌的生长繁殖被抑制，甚至死亡。（3）在多糖存在的情况下，细菌的几丁质酶、葡聚糖酶等细胞壁降解酶活性被激发出来，导致对其自身细胞壁的破坏，外部物质渗进细胞内，破坏了菌细胞的完整性，菌体死亡。

4 结论

香菇多糖对4种供试菌种都有一定的抑制作用，对沙门氏菌的抑制作用在24h时达到最大，对其它3种菌均在12h时达到最大。在酸性条件下抑菌作用比碱性条件下都强。不同浓度的香菇多糖提取液对4种供试菌的抑制作用不同，且随着浓度的增加而增加。对4种菌的抑制作用由强到弱依次为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌。

［1］常明昌.食用菌栽培学［M］.北京：中国农业出版社，2009：86－106.

［2］Yu ZH，Yin LH，Yang Q，et al.Effect of Lentinus edodes polysaccharide on oxidative stress，immunity activity and oral ulceration of rats stimulated by phenol［J］.Carbohydr Polyms，2009，75：115－118.

［3］Ng ML，Yap AT.Inhibition of human colon carcinoma development by lentinan from shiitake mushrooms（Lentinus edodes）［J］.J Altern Complement Med，2002，8：581－589.

［4］Hobbs C.Medicinal values of Lentinus edodes（Berk.）Sing.（Agaricomycet ideae）.A literature review［J］.Int J Med Mush，2000，2：287－297.

［5］吕国英，范雷法，张作法，等.香菇多糖的研究进展［J］.浙江农业学报，2009，21（2）：183－188.

［6］张欣，吕作舟.香菇多糖的提取及其理化性质的研究［J］.中国食用菌，1999，18（6）：34－35.

［7］杨凯，段作营，张建华.等.尼泊金庚酯对常见食品污染菌抑制作用的研究［J］.食品工业科技，2004，25（2）：116－118.

［8］杨惠麟.白毛藤多糖的提取及其药效学的初步研究［D］.湖南：湖南农业大学，2006.

［9］孟宪军，刘晓晶，孙希云，等.蓝莓多糖的抗氧化性与抑菌作用［J］.食品科学，2010，31（17）：110－114.

［10］Jed F Fisher，Samy O Meroueh，Shahriar Mobashery.Bacterial Resistance toβ－Llactarn Antibiotics：Compelling Opportunism，Compoelling Opportunity［J］.Chem Rev，2005，105：395－424.