四逆散中柴芍配伍对UC大鼠血清IL-6、IL-17的影响

卢 健，马 骥，陈 金，林庶茹

（辽宁中医药大学方剂学科，辽宁沈阳110032）

四逆散为临床常用经典复方，源于《伤寒论·辨少阴病脉证并治》（第318条），方由柴胡、炙甘草、枳实、芍药组成。柴胡既可疏解肝郁，又可升清阳以使郁热外透，为君药；芍药养血敛阴、柔肝平肝，为臣药；枳实理气消积，以利脾胃，为佐药；炙甘草补益脾胃、调和诸药，为使药。全方共奏透解郁热、疏肝理脾之能，又具缓急止痛、调和气血之功。用于热厥手足不温，脘腹胁痛，泻痢下重。本课题组前期通过对四逆散不同配伍干预实验性溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）的效用研究，发现四逆散能够干预实验性UC［1］。本实验在此基础上，进一步探讨四逆散方中柴芍配伍对实验性UC大鼠IL-6和IL-17的作用，为研究古典经方配伍的实验研究提供方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠（SPF级，00800161042）70只，雌雄各半，体重160 g～190 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证编号：SCXK（沪）2008-0016。

1.1.2 药物与试剂 四逆散由柴胡、芍药、枳实、甘草以1∶1∶1∶1 比例组成。柴胡免煎颗粒（0909165）、芍药免煎颗粒（0909053）、枳实免煎颗粒（0909086）、甘草免煎颗粒（0909050）均购自江苏省江阴天江药业有限公司。阳性对照药物固肠止泻丸购自沈阳市东北大药房，批号：092440，由西安阿房宫药业有限公司提供。上述药物按临床成人用量的6.3倍折算实验大鼠的用量。蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液均购自南京建成生物工程公司；完全福氏佐剂购自美国SIGMA公司；大鼠血IL-6、IL-17检测试剂盒购自北京邦定生物医学公司。

1.1.3 仪器与设备 550型酶标仪（美国BLO-RAD公司）；TDL-5-A型离心机（飞鸽牌Anke）（上海安亭科学仪器厂）；WS2-261-79型电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模及给药 根据“四逆散不同配伍干预实验性溃疡性结肠炎的效用研究”的实验结果，将实验动物分为正常组、模型组、阳性对照组、四逆散组、柴芍枳组、柴芍甘组和柴芍组7组，每组10只。采用免疫法造模［2］。刮取家兔新鲜结肠黏膜制成组织匀浆，将其以4000r/min速度离心30 min，取上清液提纯，用Lowry法测定蛋白质含量，冷藏备用。使用时与等量完全福氏佐剂充分混匀，制成抗原乳化液。于造模第1天注射抗原乳化液，分别注射于大鼠的双侧足跖、腹股沟及背部，每只约需0.5 mL；第10天，第17天，第24天依同法注射。按1 mL/100 g体重的浓度分别配制药物，于造模第2天开始分组给药。

1.2.2 标本的采集与制备 第29天给药后，称重，麻醉后于腹主动脉取血，待测指标；然后全部处死，剖取结肠，自肛门2 cm上约8 cm处，剖开、展平，肉眼观察黏膜，作出结肠组织损伤积分比较；剩余部分结肠组织以多聚甲醛固定，做病理切片，HE染色，镜下观察。

1.2.3 标本检测 采用双抗体夹心ELISA法测定，严格按试剂盒要求操作（以IL-17检测为例）。从冰箱取出大鼠血清；取出酶标板，依照次序对应分别加100 μL的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加100 μL样品于空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加50 μL的酶标记溶液；36.2℃孵育反应60 min；手工洗板6次，每次静置25 s；每孔加底物A、B液各50 μL；36.2℃避光孵育反应15 min；每孔加50μL终止液，终止反应6 min；放入酶标仪中检测，采集数据。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS10.0处理，实验数据以平均值士标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析。

2 结果

四逆散对实验性UC大鼠血清IL-6、IL-17的影响，结果见表1。

表1 四逆散对实验性UC大鼠血清IL-6和IL-17的影响（±s）

表1 四逆散对实验性UC大鼠血清IL-6和IL-17的影响（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与阳性对照组比较，3）P＜0.05；与四逆散组比较，4）P＜0.05

组别 n 血清IL-6（pg/mL） 血清IL-17（pg/mL）正常组 10 59.80±11.72 40.58±4.31模型组 10 163.64±22.171） 130.83±24.381）阳性对照组 10 96.45±8.712） 64.83±10.782）四逆散组 10 73.00±9.922）3） 52.40±8.492）3）柴芍枳组 10 131.75±31.932）3） 48.98±5.612）3）柴芍甘组 10 66.65±11.162）3） 64.12±7.621）2）4）柴芍组 10 165.95±26.883）4） 56.43±6.422）

由表1可以看出，与正常组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-17含量明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、四逆散组、柴芍枳组和柴芍甘组大鼠血清IL-6、IL-17均显著降低（P＜0.05），柴芍组血清 IL-17明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，四逆散组和柴芍甘组大鼠血清IL-6显著降低（P＜0.05），柴芍枳组和柴芍组大鼠血清IL-6显著升高（P＜0.05），四逆散组和柴芍枳组大鼠血清IL-17显著降低（P＜0.05）；与四逆散组比较，柴芍枳组和柴芍组大鼠血清IL-6显著增高，柴芍甘组大鼠血清IL-17显著升高（P＜0.05）；柴芍组大鼠血清IL-6明显高于柴芍枳组和柴芍甘组（P＜0.05），柴芍甘组大鼠血清IL-6显著低于柴芍枳组（P＜0.05），柴芍甘组大鼠血清IL-17显著高于柴芍枳组和柴芍组。

3 讨论

UC以腹泻、黏液脓血便、里急后重为主要表现，其病因及发病机制目前尚不明确，大多数医家认为与遗传、免疫、环境因素等密切相关。大量的临床与实验研究均表明，细胞因子网络平衡失调是导致UC发病的重要因素［3］。IL-6由单核巨噬细胞、T细胞等多种细胞产生，能够增强细胞和体液免疫介导的组织损伤，促进B细胞增殖、分化，趋化炎性细胞进入肠道病变部位，引起肠道炎症和组织破坏。IL-17主要由Th1细胞产生，可促进中性粒细胞的发育成熟，刺激IL-6等炎症介质的产生与分泌，是T细胞诱导和促进炎症发生过程中的一种重要因子。临床研究表明，UC患者肠黏膜组织和血清中IL-6、IL-17水平均显著升高［4-5］。

本实验结果显示，四逆散能够降低UC大鼠血清IL-6含量，效果优于对照药物固肠止泻丸；方中柴芍配伍对UC大鼠血清IL-6的作用不明显，配伍枳实后，作用稍有增强，但配伍甘草后则发挥了重要作用，其作用趋势甚至优于四逆散全方组。

造模后，各给药组实验大鼠血清IL-17含量均显著降低；与阳性对照组比较，四逆散组显著增多，柴芍枳组显著降低；与四逆散组比较，柴芍甘组显著升高；柴芍甘组显著高于柴芍枳组和柴芍组。提示四逆散能够降低UC大鼠血清IL-17含量，效果优于对照药物固肠止泻丸；方中柴芍配伍发挥了主要作用，特别是配伍枳实后，其作用趋势甚至优于四逆散全方组，但配伍甘草后作用稍有减弱。

由此可见，四逆散能够降低UC大鼠血清IL-6、IL-17水平，方中柴芍的君臣配伍对IL-17的影响发挥了主要作用，但对IL-6的作用不明显，需配伍甘草后才能发挥重要作用。

［1］卢健，范颖，马骥，等.四逆散及不同配伍干预溃疡性结肠炎的研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（16）：109-112.

［2］徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.3版，北京：人民卫生出版社，2002：1335.

［3］Goral V，Celenk T，Kaplan A，et al.Plasma cytokine levels in ulcerative colitis［J］.Hepato Gastroenterology，2007，54（76）：1130-1133.

［4］庞艳华，郑长青，王轶淳，等.IL-4和IL-13在溃疡性结肠炎中的表达［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2005，14（4）：410-412.

［5］王晓娣，董恩钰.白介素-17在溃疡性结肠炎表达的研究［J］.中华消化病杂志，2001，21（11）：673-676.