表面等离子共振生物传感器检测磺胺类药物残留*

符运良，张铁民，王林茂

(海南师范大学 物理与电子工程学院，海南 海口571158)

0 引 言

食品安全问题关系到人们的生命健康安全，得到了人们越来越多的重视。其中，食品中兽药残留问题是一个较突出的问题，食用过量的兽药残留的动物源性食品对人类的健康造成危害。世界上许多国家和组织对动物性食品中兽药残留都规定了最大的残留量，如美国和欧盟规定动物的可食用组织中的磺胺兽药残留总量不得超过100 μg/kg［1］。目前，对于动物性食品中兽药残留的检测有很多种方法，如传统的微生物检测法［2］、高效液相色谱(HPLC)法［3］、酶联免疫法(ELISA)［4］，这些方法要么耗时间过长，或检测精度低，仪器设备昂贵，同时，这些方法通常是一种检测方法对应一种药物残留，不容易实现多种残留的分析检测。基于表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)效应的生物传感器免疫法是近年来发展的一种新的检测方法，其具有实时监测分子间的相互作用、无需标记、定量准确等特点，已被广泛应用于药物研究［5］、食品分析［6］、环境监测［7］等领域。20 世纪 90 年代，瑞典的 Biacore公司将SPR 生物传感器技术引入兽药残留分析中，目前，已生产出多种检测试剂盒。国内已有利用SPR 技术进行兽药残留的研究［8～9］，该技术方法具有样品前处理相对简单、高特异性、分析快捷、定量准确等优势［10］。本研究利用SPR 技术，建立磺胺二甲嘧啶的检测方法，该方法简单、快速、灵敏度高，重复性好，适用于大量的无标记的鸡蛋或牛奶中兽药残留的检测。

1 实 验

1.1 磺胺二甲嘧啶芯片的制备

将裸金膜传感器芯片放入仪器中，在空气环境条件下进行格式化，然后，选择第2 个通道，注入蒸馏水，流过芯片表面，点击标定，出现SPR 曲线，待曲线稳定后，向金膜表面流动注入1 mol/L 11-巯基十一烷酸，时间约3 h，而后，用PBS 缓冲液冲洗，信号稳定后，在金膜表面固定一层羟基。将 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，体积比)混合后注入，活化金膜表面的羟基，形成活性酯，时间约1 h，用PBS缓冲液冲洗，注入溶液的流速均为10 μL/min，磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸缓冲液(pH =4.4)1∶50 稀释，以10 μL/min流速注入仪器中，信号稳定后，用PBS 缓冲液冲洗，这样抗原便固定在金膜上;最后，将1 mol/L 乙醇胺(pH=8.5)以10 μL/min 的流速注入，封闭金膜上未被蛋白结合的活性位点，PBS 缓冲液冲洗，完成分子识别膜的制备，原理结构如图1 所示。

图1 SPR 传感器结构图Fig 1 Structure diagram of SPR sensor

1.2 抗体工作浓度的选择

磺胺二甲嘧啶单克隆抗体，用PBS 缓冲液分别稀释为1∶100，1∶200，1∶500，1∶1000，1∶5000 倍，与浓度分别为 1，40 mg/L磺胺二甲嘧啶的PBS 缓冲液混合后，注入芯片表面，反应10 min，比较曲线，根据检测限的要求与检测范围，选择抗体工作适当的浓度。

由于抗体浓度高时，抑制样品的浓度也随着增加，导致检测的灵敏度下降，检测限提高;抗体浓度过低，竞争的抑制样品浓度范围变小，但抗体浓度越低时，检测限就越低，越有利于检测，选择较低浓度的工作抗体浓度1∶5000 稀释。

1.3 建立抑制标准曲线

以工作抗体浓度与含有不同浓度(0，1.2，2.4，8，11.5 mg/L)磺胺二甲嘧啶的PBS 缓冲液，在室温(20 ℃)下混合4 min，注入传感器中，以信号强度为纵坐标，以时间为横坐标，绘制竞争抑制曲线。

1.4 构建牛奶样品浓度抑制标准曲线

将无抗牛奶(市场购买)稀释10 倍后，离心机10000 r/min离心5 min，取中间层，加入磺胺二甲嘧啶，浓度分别为 0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入工作抗体，注入仪器中，以信号强度为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，绘制牛奶中的磺胺二甲嘧啶浓度添加竞争抑制标准曲线。

2 实验结果与分析

2.1 芯片表面固定磺胺二甲嘧啶抗原过程

将 0.4 mol/L EDC 和0.1 mol/L NHS(1∶1，体积比)混合后注入，活化金膜表面的羟基，形成活性酯，时间约7 min，SPR信号上升。用PBS 缓冲液冲洗，注入溶液的流速均为10 μL/min，将磺胺二甲嘧啶-牛血清白蛋白用醋酸液(pH=4.4)1:50 倍，以 10 μL /min 注入仪器中，结合信号上升，信号稳定后，用PBS 缓冲液冲洗，这样抗原便固定在金膜上;最后将 1 mol/L 乙醇胺(pH =8.5)以 10 μL/min 的流速注入，灭活封闭金膜上未被蛋白结合的活性位点，PBS 缓冲液冲洗，完成分子识别膜的制备，整个过程的SPR 传感信号如图2 所示。

图2 芯片表面固定抗原过程Fig 2 Process of immobilization of antigen on chip surface

2.2 磺胺二甲嘧啶浓度抑制标准曲线的建立

图3 为利用SPR 传感器免疫法检测PBS 中的磺胺二甲嘧啶所得的标准曲线，从上到下，浓度依次为0，1.2，2.4，8.0，11.5 mg/L。特异性抗原与抗体结合，在结合阶段信号强度表现为上升的结合曲线，特异性结合较为稳定，抗体与固定于芯片表面的抗原结合后，通入PBS 缓冲液达到一个相对稳定的状态，当通入洗脱液0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH 溶液，在洗脱液的作用下，才能迅速解离，基线恢复回到反应前的高度。

2.3 牛奶样品中磺胺二甲浓度抑制标准曲线的建立

图4 为牛奶样品中，磺胺二甲嘧啶浓度分别为0，0.4，0.8，5，10，50，100 mg/L，加入抗体(工作浓度)，注入仪器中，以信号强度为纵坐标，浓度以10 为底对数为横坐标，绘制得的牛奶的药物残留浓度标准曲线。将一定浓度的抗体与样品混合后，如果样品中的含有磺胺二甲嘧啶，部分抗体将被与磺胺二甲嘧啶结合，不能再与芯片表面的抗原结合，这样导致结合到芯片表面的抗体减少，结合值SPR 信号下降。因此，通过以不同质量浓度的磺胺二甲嘧啶与一定浓度的抗体混合，就可获得竞争抑制的标准浓度曲线。此外，测量样品时，由测得的数据与标准样品曲线进行比较，可计算出牛奶样品中磺胺二甲嘧啶的残留浓度值。由上述实验测得的数据，Sigmoidal 即S 型非线性关系拟合得拟合方程

y=A2+(A1－A2)/(1 +(x/x0)p).

其中，A1=3 657.724 56，A2=3010.444，x0=9.503 5，P=1.506 43。质量浓度测定线性范围为3 ～48 mg/L，可以实现牛奶样品的磺胺二甲嘧啶浓度范围的检测，最低检测浓度低于国家允许的标准限100 mg/L。

图3 抗体与抗原特异性结合的响应曲线与再生过程Fig 3 Response curves and regeneration process of specific binding between antibody and antigen

图4 牛奶中磺胺二甲嘧啶竞争抑制标准曲线Fig 4 Standard competitive inhibition curve of sulfamethazine in milk

2.4 样品浓度回收率的测定

对5 个添加磺胺二甲嘧啶的样品(40 mg/L)，分析其回收率，测定结果如表1 所示，回收率定义为各次样品检测值与检测平均值之比值，由表可知，回收率计算为99%，相对标准偏(RDS)计算值为3.2%，小于10%，表明测量的精度较高。

表1 样品浓度回收率Tab 1 Recovery rate of sample concentration

3 结 论

研究通过使用磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体与SPR 生物传感器检测PBS 缓冲液中的磺胺二甲嘧啶，对照牛奶中添加不同质量浓度的磺胺二甲嘧啶，得到标准曲线，最低检测限为2.4 mg/L。样品只需简单的稀释、离心处理即可直接测量，可以实现牛奶样品中的磺胺二甲质量浓度范围为3 ～48 mg/L，单个样品前处理5 min，测量约7 min，整个过程在16 min 之内完成，能够满足实际检测过程的需要，这种方法简单快速，抗体无需标记，样品基质的影响小，与抗原具有中等亲和力的抗体和洗脱，配合适当的样品前处理方法，可以用以检测抗体对应的小分子物质，具有广泛的应用前景。

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