白灵菇rDNA-ITS序列多态性分析

常金芳，郁建锋，冀宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

白灵菇rDNA-ITS序列多态性分析

常金芳，郁建锋，冀宏

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

为了研究10个不同来源的白灵菇品种亲缘关系，采用内转录间隔区（ITS）序列分析技术，系统分析了不同地区白灵菇ITS的多态性.用ClustalX、MEGA4等软件分析结果显示，10个不同来源的白灵菇具有很近的亲缘关系，其中有9个品种的同源性高达98.5%，其可能来自同一品系，而另一个品种与其他9个差异较大，此可能来自其他品系或是一株突变品种.

白灵菇；rDNA-ITS序列；亲缘关系

白灵菇属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，为掌状白阿魏菇，卯晓岚[1]将其命名为Pleurotus nebrodensis（Lnzengae）Quel.野生白灵菇在中国仅分布于新疆地区，其形状似灵芝，菇体为纯白色，肉质细腻，味道鲜美，朵型适中，口感特佳，是一种名贵食（药）用真菌[2].研究发现，白灵菇具有防治老年人心血管疾病、防癌抗癌等药用功效[3].白灵菇含有多种营养成分，能调节机体生理平衡、增强人体免疫功能[4-5]，享有“西天白灵芝”、“天山神菇”之美誉，深受国内外消费者的青睐，有广阔的开发前景.

Internal transcribed spacer（ITS）序列进化速率较快且片段长度适中（高等真菌一般小于1000 bp），加上协同进化，使得其在基因组中不同重复单元间十分一致，成为高等真菌属内种间及种群系统学研究的基因标记[6].ITS1和ITS2是中度保守区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异较为明显.这种特点使ITS适合于真菌物种的分子鉴定及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[7-9].目前已被广泛应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中[10].

目前，白灵菇迅速走俏市场，其栽培规模也日益扩大，但由于命名的随意性，生产中同种异名和同名异种现象严重，导致白灵菇栽培菌株混乱，影响了产业的良性发展.通过对10种不同生产区域来源的白灵菇ITS序列进行分析，探讨其种内和种间的遗传变异，为白灵菇种质鉴定及培育和优产奠定基础，提供基础保障.

1 材料与方法

1.1 菌种

分别从国内不同区域的市场菌种销售机构购买了北京吉蕈天山1号、河北武安天山2号、北京吉蕈农大白灵菇2号、江都天达白灵菇2号、福建龙海白灵菇、河南郑州白灵菇3、高邮白灵菇1号、北京吉蕈高温白灵菇、北京吉蕈京白灵菇、高邮白灵菇2号等10个不同命名的白灵菇菌种.

1.2 方法

1.2.1 白灵菇菌丝体培养

将10个不同命名的白灵菇菌种在PDA固体培养基上活化培养7 d后，接种约0.1 cm3大小的菌种块于100 m L的PDA液体培养基，25℃静置2 d后，180 r/m in继续振荡培养7 d[11].收集菌丝体，并保存于-70℃冰箱.

1.2.2 CTAB法提取基因组DNA

参照Guo[12]等和Saghai[13]等的方法，将上述操作收集到的菌丝体（湿重约0.6 g）置于陶瓷研钵中，加入适量的液氮进行研磨，将研磨得到的粉末转移到1.5 m L EP管中，加入700μL裂解缓冲液（0.1 mol/L Tris-Hcl，pH 8.0；0.02 mol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2%CTAB），置于65℃水浴消化3～4 h.然后以酚、氯仿抽提法获得白灵菇的基因组DNA，于-70℃保存.

1.2.3 PCR扩增ITS片段

ITS引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[10-11].PCR扩增100μL体系：70μL ddH2O，10μL 10×PCR buffer，8μL dNTP（2.5 mmol/L each），ITS1/ITS4（10 pmol/L）各2μL；5 ng DNA模板；1μL Taq酶（5 U/μL）.PCR扩增程序：94℃预变性3 min，94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min.

1%琼脂糖凝胶电泳检测，并克隆入pMD 18-T Vector，送至上海桑尼生物科技有限公司测序.

1.3 数据分析

利用Clustal X软件和MEGA4.1软件对所获得的10个白灵菇ITS序列进行分析[14,16-17].采用最大简约法，构建系统树，自展次数为1000次.

2 结果

2.1 ITS目的片段的扩增

以引物ITS1和ITS4扩增了10个白灵菇品种的ITS片段，从图1可以看出供试菌株扩增出来的ITS片段约在680 bp左右，而北京吉蕈农大白灵2号的PCR条带明显短于其余9个品种，基本与预期设计的片段大小相一致.

2.2 ITS序列分析

对10个白灵菇菌种的ITS序列对比分析（见图2），结果显示，北京吉蕈天山1号、河北武安天山2号、江都天达白灵菇2号、河南郑州白灵菇3、北京吉蕈京白灵菇和高邮白灵菇1号的ITS序列是相同的；福建龙海白灵菇与北京吉蕈高温白灵菇菌株的ITS序列是相同的.高邮白灵菇2号的ITS序列在第428个碱基处较其他白灵菇的多插入了1个碱基；北京吉蕈农大白灵菇2号的ITS序列与其余9个菌种的差异性较大，存在较多的序列缺失[15].

2.3 系统发育分析

2.3.1 10个白灵菇品种的遗传距离

利用MEGA4.1软件对10个白灵菇的ITS序列进行遗传关系分析，结果显示（见表1），北京吉蕈天山1号、河北武安天山2号、北京吉蕈京白灵菇、高邮白灵菇1号、高邮白灵菇2号、河南郑州白灵菇3和江都天达白灵菇2号两两之间的遗传距离都为0.000，福建龙海白灵菇和北京吉蕈高温白灵菇与以上7个品种之间的遗传距离也只有0.007，说明这9个品种的白灵菇在ITS区的变异积累并不明显.北京吉蕈农大白灵菇2号与其余9个品种的遗传距离较大，为4.337，推断其与其他白灵菇的来源可能有所不同.

图1 白灵菇ITS PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳结果

图2 10个白灵菇品种的ITS区域序列对比结果

表1 以ITS序列获得的10个白灵菇遗传距离结果

2.3.2 系统进化树

利用CLUSTALX1.83、MEG4软件，以供试白灵菇菌株的ITS序列构建其分子进化树，进一步分析10个白灵菇之间的亲缘关系.结果分析（图3）显示，10个白灵菇品种分为3大分支，北京吉蕈天山1号、河北武安天山2号、北京吉蕈京白灵菇、高邮白灵菇1号、高邮白灵菇2号、河南郑州白灵菇3和江都天达白灵菇2号聚类于同一个分支，它们之间的自展支持率为91%，大于70%.而福建龙海白灵菇和北京吉蕈高温白灵菇在同一个分支上，它们之间的自展支持率为88%，也大于70%，而后这2个分支聚类形成一个大的分支.北京吉蕈农大白灵菇2号单独形成一分支，也说明其与其他9个品种白灵菇的ITS发生了变异积累.

3 讨论

图3 基于ITS序列分析构建的最简约系统树

本文对所克隆的10个来自不同地区的白灵菇的ITS序列进行了遗传分析，并构建了其系统发育树.以北京吉蕈天山1号、河北武安天山2号之间的遗传距离为0.000，在聚类分析中其也在同一分支上，福建龙海白灵菇、北京吉蕈高温白灵菇之间的遗传距离为0.000，且自展支持率为88%，与以上7个白灵菇品种的遗传距离也只有0.007，推测这9个品种可能来自于同一品系，也有可能这9个品种的白灵菇ITS序列并没有达到亚种的遗传变异积累.而北京吉蕈农大白灵菇2号与其余9个品种的遗传距离为4.337左右，在聚类分析中单独形成一分支，推断其可能来源于其他品系或是产生的新突变株.

ITS区域的基因序列进化速率较快，且在基因组中不同重复单元之间基本一致，现为高等真菌属种内及种群系统学研究的基因标记之一[18-19].对10个来自不同地区的白灵菇ITS序列分析结果表明，只有北京吉蕈农大白灵菇2号与其他的差异较大，而其余的差异不明显.这说明此9个白灵菇品种可能来自同一品系的栽培种，也可能是ITS序列分析还不能十分精确地反映出这9个白灵菇之间的差异.因为ITS序列作为分子标记应用技术的最大限制是有的真菌由于进化顺序、变异、甚至分析方法等原因，在间隔区上表现的差异性较小，作为属内种及种群的标记存在着一定的不足[10，20].此研究结果虽然为白灵菇的种内关系的研究提供了重要参考数据，但还需结合其他方法如SRAP标记的全基因分析、白灵菇的形态包括营养体和子实体的鉴定才能更为科学地鉴定不同来源、不同品系的白灵菇之间的亲缘关系.

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An analysis of rDNA-ITS Sequence Polym orphism in Pleurotus nebrodensis

CHANG Jin-fang,YU Jian-feng,JIHong
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

In order to study the phylogenetic relationship of 10 Pleurotus nebrodensis strains collected from differ⁃ent regions,ITS sequence analysis was used.ITS sequences were amplified using primer ITS1(5′-TCCGTAGGT⁃GAACCTGCGG-3′)and ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),and analyzed using ClustalX and MEGA4 software.The results showed that the ten P.nebrodensis had a very close relationship.The similarity of 9 strains was 98.5%and they might come from the same strain.The other one was a little different from them.It might come from the other strains or be amutant variety.

Pleurotus nebrodensis;rDNA-ITS sequence;phylogenetic relationship

Q933

A

1008-2794（2012）08-0061-05

2012-06-16

常熟市农业科技项目“‘村企挂钩’食用菌设施农业标准化高效栽培技术集成与示范”（CN201001）；苏州市应用基础研究项目“白灵菇种质资源评价及其工厂化栽培良种选育”（SYN201007）；江苏省科技支撑计划项目“食用菌低碳高效生产技术体系建设与示范”（BE2011456）

常金芳（1990—），女，江苏盐城人，生物工程专业2008级本科生.

冀宏（1969—），男，河北保定人，教授，博士，研究方向：食、药用真菌工程技术，E-mail：jihong@cslg.edu.cn.