体外细胞组织重建中共培养技术的应用

谭美华，陈建苏

(1.暨南大学第一临床医学院眼科;2.暨南大学医学院眼科研究所，广东广州510632)

体外细胞组织重建中共培养技术的应用

谭美华1，陈建苏2*

(1.暨南大学第一临床医学院眼科;2.暨南大学医学院眼科研究所，广东广州510632)

细胞共培养体系在维持细胞基本结构和性状的基础上，通过两种或多种细胞组织的相互作用，使体内外环境尽可能相吻合，弥补了单层细胞培养的缺陷，有利于构建更加接近生理状态的重建体外细胞组织，被广泛应用于现代细胞研究，成为角膜、牙周、软骨、心血管以及神经细胞组织等体外构建的重要技术应用。在干细胞研究中，多孔膜两侧直接接触共培养日益受到重视，三维细胞共培养将是未来发展的方向。

细胞共培养;干细胞;组织工程

细胞培养技术已成为当今生命科学各研究领域的一项基础技术和技能，是细胞工程、基因工程和生物医学工程的重要研究手段。细胞离体后独立生存于人工培养环境中，和体内对应细胞在行为上的许多差异主要源于体外培养的细胞丧失了三维几何的空间环境，组织学所特有的异型性细胞间相互作用不复存在。20世纪80年代后期发展的细胞共培养技术是将两种或两种以上的细胞或细胞与载体培养于同一环境中的技术，建立的培养体系在维持细胞基本结构和性状的基础上，更加注重多种细胞组织在三维空间的相互作用，使体内外环境尽可能相吻合，弥补了单层细胞培养的缺陷，被广泛应用于现代细胞研究中。更好地观察细胞与培养环境之间的相互作用及可增加干细胞分化的可塑性，使得共培养技术在体外细胞组织重建的应用更加广泛。

1 细胞共培养体系建立的方法

1.1 二维共培养

1.1.1 直接接触共培养:1)多微孔膜两侧细胞接触共培养。通过插入式培养皿小室底部多孔膜的孔径使两侧细胞直接接触，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成两侧细胞胞质间的连接，同时能限制细胞的迁移，这些优势使得这种培养方式日益受到重视。在插入小室底部聚酯膜的内外两侧分别接种人髓核细胞和自体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyme stem cell，BMSCs)进行直接接触共培养，髓核细胞增殖、DNA合成和蛋白多糖含量均显著增加，BMSCs能够增强髓核细胞的生物活性，对共培养后的髓核细胞进行检验并未发现有染色体异常及肿瘤形成，为该模型应用于人体内移植提供了更加有力的证据［1］。多孔膜两侧接种人胚胎干细胞和人脂肪干细胞共培养，可使胚胎干细胞在保持干细胞特性的同时进一步扩增，且与饲养层细胞分离，避免了传代过程中酶的使用和饲养层细胞的污染，并用人脂肪干细胞代替了传统的动物细胞，增加了胚胎干细胞应用于临床的可靠性［2］。2)混合细胞共培养。在一定条件下将两种或两种以上细胞以一定比例接种在同一培养皿中，使不同种类细胞直接接触，是较早应用的直接接触共培养方法。在经化学物质诱导后的脂肪干细胞中加入小鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞NG108-15细胞株，共培养后NG108-15细胞中有神经突起的细胞数、每个细胞的神经突起数和最长突起的长度与单独培养相比均有增加，表明脂肪干细胞能够促进神经突的生长和延长［3］。通过建立大鼠BMSCs与平滑肌细胞的各种共培养体系，观察到只有两种细胞直接接触可诱导BMSCs向平滑肌细胞分化［4］。

1.1.2 非直接接触式共培养:将插入式培养皿放入相应规格的细胞培养板中，上下两层接种不同的细胞，通过培养液的成分相通作用，观察一种细胞对另一细胞的影响，是目前常用的一种共培养方式。在非直接接触共培养模型中脂肪干细胞可通过旁分泌作用促进鼓膜成纤维细胞增殖和迁移，有利于鼓膜纤维层的修复［5］。为研究BMSCs的分化状态对软骨细胞行为的影响，对BMSCs进行不同处理后与软骨细胞非直接接触共培养，观察到用成骨细胞培养基或基础培养基前期诱导分化4 d的BMSCs可使软骨细胞的黏多糖显著增加［6］。

1.2 三维细胞共培养

三维培养中细胞通过紧密连接或缝隙连接等方式建立联系，在基因表达、基质分泌及细胞功能活动等方面与二维培养均有明显差异，而与体内细胞生长情况更为相似。将人脐静脉内皮细胞与人肝细胞放在合成的聚醚醚酮-聚氨酯及壳聚糖膜上建立共培养系统，膜的一些特性可促进细胞黏附并诱导内皮细胞毛细管样结构形成以及ECM蛋白分泌，此共培养系统可显示肝脏的分泌功能并用于肝脏组织的生物制造［7］。在自制的聚乳酸-羟基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic)acid，PLGA］支架上接种经成骨细胞培养基前期诱导分化的BMSCs，在负载聚乙二醇［poly(ethylene glycol，PEG)］的水凝胶上接种软骨细胞，再将两种材料聚合进行三维共培养，观察到BMSCs能够促进软骨细胞黏多糖增加［6］。

1.3 其他

1)用一种细胞的培养上清液与另一种细胞共培养。收集小鼠胚胎干细胞的条件培养基，以25%的比例加入到角膜内皮培养基后培养人角膜内皮细胞，多边形内皮细胞传至第6代时体积不变大，Ki67蛋白阳性细胞数、集落形成率、进入S和G2期的细胞数均高于普通培养组，说明胚胎干细胞条件培养基能够增强人角膜内皮细胞的体外扩增能力［8］。2)用细胞裂解液或组织匀浆液与另一种细胞共培养。将兔角膜缘基质制成匀浆再添加DMEM/F12培养毛囊干细胞，角蛋白K12明显表达，提示角膜缘基质匀浆液能提供类似体内角膜缘微环境中的因子，促进毛囊干细胞向角膜上皮细胞分化［9］。不同浓度心窦房结细胞裂解液与大鼠BMSCs共培养，能够诱导BMSCs向心肌样细胞分化，且分化后的细胞具有起搏功能［10］。

2 细胞共培养在体外细胞组织重建的应用

2.1 在角膜细胞组织体外重建的应用

合适的种子细胞是组织工程眼表重建技术的关键之一。建立眶周脂肪干细胞(orbital fat-derived stem cells，OFSCs)与人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cells，HCE-T)直接混合和非直接接触两种二维共培养体系，HCE-T细胞培养基培养OFSCs设为对照，发现混合培养组可检测到部分OFSCs表达CK19及CK3，而在非直接接触共培养组及对照组检测不到，表明OFSCs可分化为角膜上皮细胞，直接接触是其分化的必要条件，显示了其在细胞治疗由角膜上皮细胞丢失引起的角膜疾病的潜在临床应用［11］。

2.2 在牙周细胞组织研究的应用

BMSCs与牙周韧带细胞混合共培养后骨钙蛋白和骨桥蛋白表达显著增加，骨唾液酸糖蛋白表达明显下调，表明两种细胞直接接触及牙周韧带细胞分泌的一些因子可诱导BMSCs获得牙周韧带样的特性，提示BMSCs应用于牙周组织再生和修复的可能［12］。

2.3 在心血管系统的应用

将人脐静脉内皮细胞与BMSCs进行非直接接触共培养，BMSCs可被诱导为内皮样细胞，诱导后的细胞从形态到表型特征都与成熟内皮细胞相似，传代扩增迅速并能够在脱细胞牛颈静脉血管支架上黏附生长，为BMSCs用于人工血管或瓣膜的细胞种植提供了一种新的途径［13］。

2.4 在软骨细胞组织体外重建的应用

将负载软骨细胞和负载胚芽来源细胞的水凝胶聚合进行三维共培养，3周后移植到无胸腺雄性裸鼠，6周后取出检测，胚芽来源细胞能够在体内继续分化，移植物中有细胞外基质产生和新生软骨形成［14］。软骨细胞和BMSCs非接触共培养能诱导BMSCs分化为较成熟的软骨细胞并形成小的软骨样组织，有II型胶原的分泌，与条件培养基诱导的软骨细胞相比，共培养诱导的软骨细胞更有利于作为组织工程软骨的种子细胞［15］。

2.5 在神经细胞组织体外重建的应用

组织工程神经作为移植的替代物，已成为神经缺损修复的一个重要研究领域。经过神经营养蛋白-3基因修饰的血旺细胞(Schwann cells，SCs)与络氨酸蛋白激酶C基因修饰的BMSCs共培养于带有多管道的PLGA导管，可促进BMSCs向神经样细胞分化，并有突触样结构形成，人造BMSCs/SCs/PLGA复合体有望应用于脊髓损伤的治疗［16］。

3 问题与展望

细胞共培养体系能够增加干细胞分化的可塑性，构建的三维模型更接近于体内的真实环境，成为近年来组织工程研究的热点。但共培养体系的建立和应用仍存在一些不足，混合共培养模型中两种细胞分离较困难，不便于区别观察和后续检测，需结合一定的分选技术。非直接接触共培养可分别观察两种细胞的形态变化及得到相对高纯度的细胞进行功能检测，弥补混合培养模式的不足，但它只能通过旁分泌的细胞因子相互作用，丧失了细胞与细胞的直接接触作用，与体内环境存在一定的差异，相比较而言，利用多微孔膜建立的直接接触共培养更为理想，既有可溶性分泌因子的相互交流，又能形成两侧细胞胞质间的连接，同时能限制细胞的迁移，在二维细胞培养中将得到更加广泛的应用和发展。而三维细胞共培养同时有细胞间的直接接触和分泌因子的流通，能够提供细胞更充分的立体生长空间，模型更符合生理学特点，为将来细胞组织体外重建研究进一步添加神经和血管的介入奠定了更加坚实的基础。

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The application of cell co-culture in the reconstruction of cells and tissues in vitro

TAN Mei-hua1，CHEN Jian-su2*

(1.Dept．of Ophthalmology，the First Clinical Medical College of Jinan University;2.Eye Institute，Medical College of Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Based on maintaining the fundamental structures and properties of cells，the cell co-culture system makes the environmentin vitroto be similar within vivoenvironment as far as possible through interactions of two or more kinds of cells and tissues．So the cell co-culture system makes up for the defects of monolayer cell culture and is conducive to reconstructing cells and tissuesin vitrocloser to the physiological state．The system is widely used in modern cell research，which makes it to be an important technology for the cells and tissues reconstructionin vitroof cornea，periodont，cartilage，cardiovascular，neural，et al．In the field of stem cell research，the co-culture system of direct contact through porous membrane has been paid much attention recently and three-dimensional culture will be the focal point in the future．

cell co-culture;stem cells;tissue engineering

R-331

A

1001-6325(2012)09-1111-04

2011－11－02

2011－12－28

*通信作者(corresponding author):chenjiansu2000@163．com