葡萄球菌耐药性的进展

董泽欣 综述，夏永祥审校（南京医科大学附属南京医院/南京市第一医院医学检验科 210006）

金黄色葡萄球菌（下称金葡菌）广泛分布于自然界，很容易获得抗生素耐药性[1]。金葡菌对青霉素耐药出现于1994年，而对甲氧西林耐药出现于1961年，万古霉素是治疗耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的首选药物，然而1996年日本发现对万古霉素中介的金葡菌（VISA），2002年和2004年美国又相继报道3例对万古霉素高度耐药的金葡菌（VRSA）。万古霉素耐药金葡菌的出现使细菌感染再次成为非常棘手的临床问题[2]。葡萄球菌的耐药特征及耐药机制主要是由于产生β－内酰胺酶，可对β－内酰胺类抗生素产生不同程度的耐药。近年来，由于β－内酰胺类、氟喹诺酮类等抗生素的广泛应用，使耐药葡萄球菌株尤其是MRSA不断增多[3]。MRSA的特点为多重耐药，对现有的β－内酰胺类抗生素，如青霉素类和头孢菌素类均不敏感，对氯霉素、林可霉素、氨基糖苷类、四环素类和大环内酯类抗生素及喹诺酮类药物也不敏感[4]。MRSA多重耐药机制：多重耐药MRSA有着不同一般产酶耐药金葡菌的独特耐药机制。目前已经知道，MRSA主要耐药机制是由于细菌细胞膜上的青霉素结合蛋白（PBPs，是细菌细胞壁合成过程中维持其生理功能不可缺少的酶蛋白系）有重要改变。MRSA能产生一种甲氧西林敏感的金葡菌（MSSA）所没有的PBPs，称为PBP2a，由于PBP2a与抗菌药物的亲和力极低，且能代替其他PBPs功能，当与β－内酰胺类抗生素具有高亲和力的PBPs被β－内酰胺类抗生素结合失去活性时，PBP2a的存在仍能维持细菌生长和成活。因此，在高浓度抗生素存在的环境下细菌得以生存，使其成为耐药菌株。

1 MRSA耐药性研究进展

1.1 MRSA的耐药机制 青霉素耐药金葡菌能产生β－内酰胺酶，水解青霉素中有效基团。甲氧西林耐药金葡菌获得一个耐药基因（mecA）基团，编码产生PBP2a，对β－内酰胺类抗生素敏感性减低。对万古霉素耐药的金葡菌是获得万古霉素耐药肠球菌（VRE）的耐药基因，使万古霉素失去作用位点；或是细胞壁增厚，使万古霉素不能到达作用靶位。

在MSSA中含有5种与β－内酰胺类抗生素亲和力高的PBP，即PBP1、PBP2、PBP3、PBP3′和PBP4，总称为PBPs，PBPs具有羧肽酶或转肽酶作用，主要参与细胞壁黏肽层的合成，对于细菌生长、繁殖、保持正常形态起重要作用，是细菌生长、繁殖所必需的。MSSA中PBPs和β－内酰胺类抗生素结合后，酶功能被抑制，使细胞壁合成受阻，导致细菌因不能抵抗外界的渗透压力而死亡。MSSA活动一个mecA后即为MRSA。mecA能编码合成一种新的PBP2a，PBP2a能执行PBPs的生理功能，但与β－内酰胺类抗生素亲和力低。当有β－内酰胺类抗生素存在时，正常的PBPs与之结合，功能被抑制，而PBP2a不与之结合，则可代替PBPs发挥作用，使细菌能够正常生长，产生耐药性。

1.2 MRSA基因分型及其意义 编码PBP2a的mecA基因不是MRSA菌株所固有的，而是一个外来的插入片段，该片段以基因复合体的形式存在，携带mec基因盒（SCC－mec），SCC－mec包括两种基因复合体：（1）mec基因复合体；（2）染色体盒重组基因复合体（ccr）。

根据mec和ccr基因复合体结构，可将SCC－mec分为4型。Ⅰ型：由B型mec基因复合体和ccr1型基因复合体组成，多见于早期分离的MRSA菌株，代表株为NCTC10442，是1961年首次从英国分离出的MRSA菌株[5]。在Ⅰ型中除mecA基因外没有其他耐药基因。Ⅱ型：由A型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成，是目前医院感染MRSA中常见的基因型，代表株为N315，是1982年从日本分离的 MRSA菌株[6]。在Ⅱ型SCC－mec的J区中含有完整的Pub110质粒和Tn554转座子，Pub110与细菌对氨基糖苷类耐生素、卡那霉素、妥布霉素耐药有关，Tn554编码红霉素、壮观霉素耐药性。Ⅲ型：由A型mec基因复合体和ccr3型基因复合体组成，也是医院感染MRSA常见的基因型，代表株85/2082，是1985年从新西兰分离的MRSA菌株。在Ⅲ型SCC－mec中mecA以外，还含有完整的pT181质粒、Tn554转座子和jTn554。jTn554是编码抗镉的基因，pT181质粒编码四环素耐药、Tn554编码红霉素、壮观霉素耐药性。Ⅳ型：由B型mec基因复合体和ccr2型基因复合体组成。是新出现的社区感染MRSA常见基因型，MW2和CA05为Ⅳa型代表菌株，8/6－3P为Ⅳb型代表菌株，在Ⅳa和Ⅳb型SCC－mec中除mecA外，不含其他耐药基因。

1.3 社区感染 MRSA（CO－MRSA） CO－MRSA是近年来出现的一种新的耐药模式，在美国、澳大利亚引起广泛重视[5]。CO－MRSA多为Ⅳa或Ⅳb基因型，仅含mecA基因，与典型的医院感染MRSA（H－MRSA）比较，主要的特征是仅表现为对β－内酰胺类抗生素耐药，而对多种非β－内酰胺类抗生素（如庆大霉素）的敏感性可能增加，甚至仅对青霉素类耐药，对头孢类抗生素也表现为敏感。与H－MRSA比较，CO－MRSA的毒性更强，可产生杀白细胞毒素。较多的研究认为，CO－MRSA并非起源于H－MRSA，而是一种新的耐药模式。

2 万古霉素耐药金葡菌（VRSA）研究进展

2.1 种类 万古霉素金葡菌一般分为3种：VRSA、VISA和Hetero－VRSA。VRSA是指临床分离的金葡菌对万古霉素的MIC≥32mg/L，于2002年在美国首次报道[7]，至今在全世界仅报道3例。VISA指金葡菌对万古霉素的MIC为8～16 mg/L，于1997年由日本学者首先分离出第1株对万古霉素中度耐药的金葡菌（Mu50，MIC＝8mg/L），随后美国和中国等又陆续发现多株VISA[8]。hetero－VRSA指从临床标本分离的金葡菌原代纯培养物，万古霉素的 MIC≤32mg/L，但在万古霉素敏感的原代中，存在有部分对较高浓度万古霉素耐药的亚群，这些耐药亚群可以通过一定方法从原代菌株中检测出来，对选择出的耐药亚群做万古霉素MIC测定，浓度可以增加2～8倍。1996年日本首先分离出hetero－VRSA（Mu3，MIC＝3 mg/L），此后许多国家相继有报道。

2.2 耐药机制

2.2.1 耐药质粒传递，1992年Noble成功地将粪肠球菌耐药质粒传递给金葡菌，在实验室内构建成“VRSA”。美国于2002、2004年共分离出3株VRSA，均检测出与VRE一致的vanA基因。金葡菌分泌一种肽，其活性类似于粪肠球菌的性信息素CAM373。Sasha等发现携带有vanA基因的粪肠球菌对这种肽产生反应，通过信息素相关过程把其耐药质粒转移至金葡菌体内[9]。经这种机制获得的耐药一般呈高水平，MIC值可达到1 024mg/L。

2.2.2 染色体突变 VISA和hetero－VRSA菌株的大量研究中并没有发现vanA、vanB或VanC基因。但是，日本学者认为以克隆型ⅡA为代表的MRSA比世界其他国家的金葡菌更容易产生对万古霉素耐药的潜能[10]。George等测定了6株分离于美国的VISA，发现他们都属于附属基因调节子Ⅱ族（agrⅡ），并且发现从血液中分离出的MRSA中有56%属于agrⅡ族（n＝148），而仅有24%MSSA属于agrⅡ族（n＝33），大量基因分析证实了agr基因点突变引起的功能丧失，更易使agrⅡ型金葡菌发展为hetero－VRSA，故认为hetero－VRSA的产生可能与agrⅡ型功能丧失有关。

2.2.3 细胞壁增厚 Daum在1992年报道了一株在实验室通过耐药平板诱导而对万古霉素敏感性降低的金葡菌[11]，这株金葡菌细胞壁增厚，对溶菌酶敏感性减低，也丧失了噬菌体和荚膜分型。日本学者Cui用透射电镜技术对自7个国家分离的16株VISA进行观察，发现VISA细胞壁平均厚度为31.3nm，而万古霉素敏感菌株VSSA细胞壁的厚度仅为23.4 nm，二者存在明显差异。

2.2.4 糖肽链间交联减少 肽聚糖交联减少是金葡菌对万古霉素耐药机制之一。有研究发现，肽聚糖单体五肽支链上的谷氨酸残基未被酰胺化是导致肽聚糖链间交联减少的主要原因。金葡菌合成肽聚糖有两种途径：一种途径以N－乙酰葡糖胺为原料，另一种以葡萄糖为原料。研究发现，在VISA中第1种合成途径与VSSA并无明显差异[12]，而第2种途径却明显增强。在该途径中，金葡菌摄取环境中的葡萄糖并将其转化为6－磷酸果糖，L－谷氨酰胺－6－磷酸果糖转氨酶又将6－磷酸果糖转变为6－磷酸葡糖胺过程中十分关键，因为它能提供必需的NH4＋。

2.2.5 PBPs与其耐药性的相关性 PBPs是存在于细菌细胞内膜上一群能同青霉素和其他β－内酰胺类抗生素螯合的细菌蛋白，即抗生素作用的靶位点。据分析：所有耐药菌株PBP2结合青霉素的能力都明显增强，PBP2产量增加，且PBP2产量增加与菌株对万古霉素 MIC增加呈正关系（r＞0.9），推测可能PBP2与万古霉素竞争结合肽聚糖前体上的靶位，阻碍万古霉素与靶位结合，导致敏感性下降[13]。PBP4具有D－羧肽酶活性，可以从未形成交联的细胞壁上切除D－丙氨酸残基，避免过多的D－丙胺酰－D－丙氨酰五肽形成，从而保证万古霉素有效地作用于金葡菌。Patel等[13]通过基因替补技术，发现在体外诱导产生的VISA中，PBP4活性较VSSA明显减少，但二者的PBP4结构基因及侧翼序列并无活性区别，推测可能与VISA在最低抑菌浓度的万古霉素作用下编码PBP4的质粒减少有关。

3 MRSA感染的治疗对策

MRSA常发生于医院内患者或接受医疗器械治疗的患者。尤其是年老、体弱、免疫抑制的疾病（如艾滋病）、有开放性创伤（如褥疮）或使用导管（如导尿管或静脉导管）的住院患者。另外，先前抗生素应用的选择压力、入住重症监护病房、外科手术、长期住院、与MRSA携带者接触、携带MRSA于鼻前庭但并未发病等也常常是感染 MRSA的危险因素。

3.1 单产生β－内酰胺酶的葡萄球菌 对β－内酰胺酶不稳定的青霉素类耐药，主要包括阿莫西林、氨苄西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、美洛西林等，但对β－内酰胺酶稳定的青霉素类敏感，主要包括甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、奈呋西林，以及对β－内酰胺酶抑制剂类、头孢菌素类和碳青霉烯类均敏感的。这类菌株单产β－内酰胺酶，首选耐青霉素酶的青霉素类和利福平或庆大霉素治疗，如果患者对β－内酰胺类过敏可选择氟喹诺酮类、克林霉素、大环内酯类或磺胺类治疗。

3.2 发生PBP2a突变的菌株 MRSA对所有β－内酰胺类抗生素均耐药，因此，实验室仅测试青霉素和苯唑西林就可以推测一大批β－内酰胺类抗生素的敏感性和耐药性。MRSA常见的敏感抗生素为万古霉素、替考拉宁、利奈唑烷、复方磺胺、利福平、链阳霉素。糖肽类抗生素是治疗 MRSA感染非常有效的一类抗生素，长期应用万古霉素对MRSA的治疗导致90年代临床发现了对万古霉素耐药的凝固酶阴性葡萄球菌及VISA和VRSA。目前为止，世界上已报道多例VISA感染病例及2例VRSA感染的病例。

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