单核细胞增生性李斯特菌自溶素研究进展

崔焕忠，张 辉，范译文，康 倩，钱爱东*

(吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

单核细胞增生性李斯特菌自溶素研究进展

崔焕忠，张 辉，范译文，康 倩，钱爱东*

(吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

自溶素是由细菌产生的可以降解细菌细胞壁的肽聚糖水解酶，参与细菌的分裂、细胞壁更新、细菌自溶等生理过程。自溶素也是细菌的重要毒力因子之一，参与细菌的黏附与侵袭，与细菌的致病性密切相关。本文对单核细胞增生性李斯特菌的胞壁水解酶p60、酰胺酶Ami、自溶素IspC、自溶素Auto与胞壁水解酶MurA等自溶素的蛋白结构、生理功能及致病性进行了简要介绍。

单核细胞增生性李斯特菌；自溶素；研究进展

单核细胞增生性李斯特菌是一种重要的食物源性人兽共患病病原菌，为革兰氏阳性胞内寄生菌，在食品污染中广泛存在，人们极易通过食用污染的食品而感染发病，儿童、孕妇、老年人及免疫功能低下者更易感染发病。被世界卫生组织列为仅次于大肠杆菌O157、沙门氏菌、志贺氏菌后的第四大重要的食源性致病菌。因此应加强该致病菌的深入研究，建立快速有效的检测方法，保障食品质量安全，以降低该病的发病率；寻找新型无抗性的生物制剂用于该病的治疗，以降低该病的死亡率，为该病的防治奠定基础。

自溶素(autolysin)为细菌的表面蛋白，具有肽聚糖水解酶活性，可以降解细菌细胞壁，与细菌多种生物学功能有关，如细胞壁翻转、细胞分裂、细胞分离、趋化作用、生物膜形成、遗传转化能力、蛋白质分泌、鞭毛与孢子形成及抗生素诱导裂解等，对细菌的生存和致病性至关重要[1]。根据自溶素作用位点的不同，可将其分为以下几类：N-乙酰胞壁酸酶，作用于N-乙酰胞壁酸与N-乙酰葡萄糖胺之间的1,4-糖苷键；N-乙酰糖苷酶，作用于N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的1,4-糖苷键；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，作用于N-乙酰胞壁酸的D-乳酸与L-丙氨酸之间的酰胺键；肽链内切酶；糖基转移酶[2]。近年来，多种自溶素在革兰阳性细菌中得到证实，如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、山羊葡萄球菌(Staphylococcus caprae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)和变异链球菌(Streptococcus mutans)等[3-4]。

研究表明自溶素在单核细胞增生性李斯特菌也普遍存在，通过蛋白的分离纯化与表达，目前已经证实的自溶素有7种，其中包括胞壁水解酶p60、酰胺酶Ami、表面蛋白P45、自溶素IspC、自溶素Auto、胞壁水解酶MurA及表面蛋白FlaA等，上述自溶素参与细菌细胞的分裂与分离、肌动蛋白尾的形成、调节表面蛋白的分泌表达等生理过程，以及细菌的黏附与侵袭、细菌在细胞内的生长、细菌从细胞到细胞的扩散等致病过程，与其毒力密切相关。

1 胞壁水解酶p60

p60蛋白也称为cwhA(cell wall hydrolase A)，由iap(invasion-associated protein)基因编码，分子质量为60kD，等电点(pI)为9.75，它是一种胞外蛋白，具有胞壁水解酶和酰胺酶活性。由N端到C端分别为信号肽、SH3区、Thr-Asn的重复区、胞壁水解酶活性区。p60蛋白存在于所有李斯特菌中，其C端和N端分别为由100个和120个氨基酸组成的保守区，中间区域高度可变[5]。因此可利用iap基因两端序列设计引物，进行李斯特菌属的鉴定，利用中间区域可变性进行李斯特菌种的鉴定[6]。iap基因的表达不被prfA所调控。p60蛋白是单核细胞增生性李斯特菌的主要保护性抗原之一，常用于疫苗研制的候选抗原[7]。p60蛋白与细菌的侵袭性密切相关，iap基因缺失突变体对Caco-2细胞及3T6细胞的黏附能力降低。p60蛋白对于细胞的分裂必不可少，iap基因缺失后缺少细胞分裂，造成在隔膜形成后，ActA在隔膜形成点沿着鞭毛聚集，而没有聚集在鞭毛尾部，不能形成F-肌动蛋白尾，使细菌丧失基于肌动蛋白的运动性，导致突变体在细胞间的扩散能力下降而使其毒力显著降低[5]。以iap基因缺失突变体静脉接种小鼠，与野生型菌株相比，小鼠肝脏及脾脏细菌计数明显减少，表明缺失iap基因后细菌毒力显著降低。在细菌感染早期，p60蛋白以间接的方式激活NK细胞，产生大量IFN-γ，从而可能通过对外围细胞的免疫调节促进细菌感染早期的扩散[8]。Sashinami等[9]研究p60蛋白对宿主天然免疫反应的影响，结果发现重组p 6 0蛋白可以刺激幼鼠RAW264.7巨噬细胞产生TNF-α，调节抗单核细胞增生性李斯特菌感染的天然免疫反应。

2 酰胺酶Ami

酰胺酶Ami的大小在不同血清型中存在差异，在1/2a血清型中由917个氨基酸组成，分子质量为102kD，而在4b血清型由770个氨基酸组成。尽管不同血清型间Ami的大小不同，但是其N端的同源性高达98%，然而C端的同源性只有54%，并且C端的甘氨酸-色氨酸模序(glycine-tryptophan，GW模序)，GW的数量在不同血清型中不同，1/2a血清型有8个，而4b血清型有6个[10]。Ami的N端为催化域，与金黄色葡萄球菌At1自溶素的酰胺酶区域相似，C端为细胞壁锚定结构域。Ami除裂解细菌细胞壁外，还可以通过其细胞壁锚定结构域使细菌黏附至靶细胞表面，参与细菌的黏附过程。不同血清型的单核细胞增生性李斯特菌对Hep-G2细胞的黏附能力不同，1/2a血清型黏附能力强于4b血清型[11]。Ami与细菌毒力相关，参与小鼠肝细胞的黏附与内化过程，从而发挥其致病作用，同时通过发挥肽聚糖水解酶活性裂解菌体，释放细胞壁免疫活性物质，增加TNF-α和IL-6的产生释放，在细菌感染早期激发宿主主动免疫反应[12]。

3 自溶素Auto

Cabanes等[13]通过硅片对比分析单核细胞增生性李斯特菌和无致病性的无害李斯特菌的基因组，结果发现一个在无害李斯特菌基因组中不存在的基因auto，auto基因也是唯一一个在无害李斯特菌中不存在的自溶素基因。auto基因编码一种具有自溶活性的表面蛋白Auto，该蛋白由572个氨基酸残基组成，分子质量为62kD，包括由26个氨基酸残基组成的信号肽序列、N端自溶结构域(第75～243位氨基酸)及C端细胞锚定结构域(第244～572位氨基酸)[14]。锚定结构域与Ami、金黄色葡萄球菌的自溶素Atl、AtlC、AtlE及Aas相同，由GW模序组成，但是GW模序的数量不同为4个。auto基因的表达不被prfA调控。Auto不参与细胞黏附，但与侵入真核细胞有关。auto基因缺失突变体对一些上皮细胞和成纤维细胞的侵袭力降低，但不影响其在鼠巨噬细胞如J774中的侵袭力，同时该突变体对豚鼠和小鼠的毒力降低。Auto对单核细胞增生性李斯特菌的侵袭是必需的，但是需与其他黏附侵袭相关毒力因子协同作用[15]。

4 自溶素IspC

IspC是由Wang Linru等[16]于2008年发现的一种具有免疫原性的细菌表面蛋白，由774个氨基酸残基组成，具有由23个氨基酸组成的信号肽序列，成熟蛋白的分子质量为84kD，pI为9.4，与Auto和Ami相似，具有N端催化域(第24～197位氨基酸)及由7个GW模序组成的C端细胞壁锚定结构域(第198～774位氨基酸)。同野生型菌株相比，ispC基因缺失突变株在体外生长、复制、微观形态以及生化特性方面没有改变，但是对小鼠毒力明显降低，表现在肝脏和心脏的细菌计数显著减少，并且没有死亡[17]。IspC与细菌细胞的分裂与分离无关，但是与细菌的毒力密切相关，在细菌感染过程发挥多种功能，参与细菌的黏附与内化，细菌从细胞到细胞的扩散，在胞内感染早期参与肌动蛋白尾的形成，感染后期与细菌在胞内的生长有关。IspC通过细胞类型依赖方式参与Hep-G2细胞、Vero细胞与SCP细胞的黏附及Caco-2细胞、Hep-G2细胞、Vero细胞、L132细胞与SCP细胞的内化。以C端细胞壁锚定结构域特异的结合到SCP细胞和Vero细胞表面，从而参与细胞的黏附。ispC基因缺失突变株对人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell，HBMEC)的黏附能力没有变化，表明IspC可能为细菌通过血脑脊液屏障所必需。蛋白质组学和免疫学分析表明，由于IspC的缺失导致ActA、InlC2 及 FlaA表面蛋白的表达量减少。N端催化域调节包括ActA、鞭毛蛋白、InlB前体、p60蛋白及InlA在内的表面蛋白的分泌表达[16]。

5 P45蛋白

Schubert等[18]以4d血清型单核细胞增生性李斯特菌免疫小鼠制备单克隆抗体，发现该单克隆抗体与分子质量为45kD的蛋白(P45)反应，该蛋白不仅存在于细菌表面，也能分泌到培养液中。利用李斯特菌属不同菌种与单克隆抗体进行交叉反应，结果表明除了格氏李斯特菌外，该单克隆抗体与其他李斯特菌均发生反应。将编码蛋白的结构基因克隆到大肠杆菌中并进行测序，发现该基因编码的蛋白由402个氨基酸残基组成，预计分子质量为42.7kD，具有由27个氨基酸残基组成的信号肽序列，成熟蛋白的分子质量为39.9kD，与p60的同源性为55%，与粪肠球菌P54蛋白及乳酸乳球菌Usp45蛋白的同源性较高，具有肽聚糖水解活性。将该编码基因命名为spl (secreted protein with lytic property) 。

6 胞壁水解酶MurA

MurA是一种表面蛋白，由590个氨基酸残基组成，分子质量为66kD，具有由52个氨基酸组成的信号肽序列，成熟蛋白的分子质量为58kD，在MurA的149～301位氨基酸之间具有甘露糖基糖蛋白内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶保守催化谷氨酸和天冬氨酸残基的结构域。N端序列与革兰氏阳性菌的溶菌酶同源，C端为细胞锚定结构域，具有4个由赖氨酸模序组成的重复区域，每个区域由43个氨基酸组成，重复区域之间由富含丝氨酸、苏氨酸与天冬酰胺的序列间隔开，重复区域之间的同源性为76%，C端重复区域与希氏肠球菌的胞壁质酸酶-2及乳酸乳球菌与粪肠球菌的胞壁水解酶的同源性为80%，与p60蛋白的N端两个由赖氨酸模序组成的重复区域高度同源。

MurA具有胞壁水解酶活性，参与细胞分离，murA基因缺失突变株不能表达胞壁水解酶，造成细菌在对数生长期形成长链，不能分离。而将murA基因重新整合到murA基因缺失突变株染色体上，细菌则恢复表达胞壁水解酶和细胞分离的能力。在不利于细菌生长的条件下，MurA参与细菌的裂解，同时MurA也是发挥菌体自溶功能的主要蛋白。p60蛋白与酰胺酶Ami通过参与细胞的黏附，直接发挥其致病作用，而MurA则通过菌体自溶，释放细胞壁免疫活性成分和毒素，从而间接发挥细菌的致病性[19]。

7 表面蛋白FlaA

Popowska等[20]利用氯化锂处理细菌细胞获得分子质量为29kD的表面蛋白，利用快速蛋白液相层析(FPLC)将其分离，采用明胶酶谱分析证实该蛋白具有肽聚糖水解酶活力。双向电泳后进行测序分析，证实该蛋白为FlaA蛋白。FlaA蛋白由flaA基因编码，为细菌表面的鞭毛蛋白。Dons等[21]构建了flaA基因缺失突变株，研究表明同野生型菌株相比，该突变株对Caco-2细胞的侵袭能力降低，FlaA蛋白参与上皮细胞的黏附，并可激发宿主的免疫反应，诱导TNF-α和IL-1的产生。Shen等[22]研究发现，在37℃培养条件下及细胞内感染阶段，MogR蛋白抑制FlaA蛋白的表达，DNA 结合与微阵分析表明MogR蛋白通过直接与位于转录启动区内的两个TTTTN5-AAAA结合，从而阻遏RNA聚合酶结合，抑制所有鞭毛运动基因的转录。上位分析表明MogR蛋白抑制基因转录由反应调节子DegU以温度依赖方式拮抗，DegU通过转录后机制调节FlaA蛋白的水平。

8 其 他

除了上述自溶素外，单核细胞增生性李斯特菌可能编码自溶素还有Lmo0327蛋白，Lmo0327蛋白为细菌的表面蛋白，具有胞壁水解酶活性，分子质量为144kD，具有信号肽序列、N端LRR结构域及C端锚定结构域，通过LPXTG模序与细胞壁胞壁酸共价结合。Lmo0327蛋白的表达可能由上游的转录调节子Lmo0326正向调控。Lmo0327蛋白参与细胞的分离及细胞壁的翻转[23]。此外，预测lmo1521和lmo2203编码产物与Ami和Auto相似，具有肽聚糖水解区和GW模序，可能具有自溶活性[24-25]。

9 结 语

因为李斯特菌产生的自溶素仅对李斯特菌起作用，可特异性的破坏细菌细胞壁结构，而不影响其他正常菌群，并且很容易通过基因工程技术获得和修饰改善，而且其重组蛋白同样具有水解活性，因此有望开发成为一类新型抗菌制剂，用于治疗李斯特菌感染[26]。目前，肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌的自溶素已经成为新型抗菌药物的研发热点，研究表明肺炎链球菌自溶素LytA在体内外都能有效的溶菌，静脉注射可以治疗耐药肺炎链球菌引起的腹膜炎——败血病等[27]。Sinch等[28]通过研究同源金黄色葡萄球菌的自溶素缺陷株和野生株发现，苯唑西林及万古霉素等抗生素能与细菌自有的自溶素联合增强抑菌作用。肺炎链球菌自溶素LytA是肺炎链球菌表面重要的毒力因子，存在于所有肺炎链球菌菌株中，并且高度保守，是理想的疫苗候选抗原[29-30]。由于auto基因是唯一一个在无害李斯特菌中不存在的编码自溶素的基因，因此可将其作为单核细胞增生性李斯特菌与无害李斯特菌鉴别诊断的候选基因。此外，也可利用自溶素基因的保守片段建立检测及诊断方法，为食品检测及疾病的诊断提供可靠的参考依据。

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Research Progress in Autolysin from Listeria monocytogenes

CUI Huan-zhong，ZHANG Hui，FAN Yi-wen，KANG Qian，QIAN Ai-dong*
(College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Autolysin is a kind of peptidoglycan hydrolase produced by the bacteriumb and able to degrade its own cell wall. This enzyme is involved in numerous cellular processes including cell division, cell-wall turnover and bacterial lysates. Autolysin is closely associated with pathogenicity, which participated in host cell adhesion and invasion. The protein structure, physiological function and pathogenicity of autolysins in Listeria monocytogenes, such as p60, Ami, IspC, Auto and MurA are reviewed here.

Listeria monocytogenes；autolysin；progress

Q939.94

A

1002-6630(2012)11-0290-04

2011-05-11

2007年度高等学校博士学科点专项科研基金项目(20070193062)

崔焕忠(1973—)，男，副教授，硕士，研究方向为动物疾病诊疗新技术。E-mail：huanzhongcui@163.com

*通信作者：钱爱东(1960—)，男，教授，博士，研究方向为动物病毒学。E-mail：qianaidong0115@163.com