传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

叶敬礼 （江苏省宿迁市宿豫区农业委员会 223800）



传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

叶敬礼 （江苏省宿迁市宿豫区农业委员会 223800）

猪高热综合征是近年来由多种病原混合感染和继发感染引起的一种以发热、皮肤发红、出现呼吸道和繁殖障碍等为主要特征的综合征。其中胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引起呼吸道症状并加大治疗难度的重要病原之一。APP引起的猪传染性胸膜肺炎，是一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失。本试验对猪高热综合征中胸膜肺炎放线杆菌的感染进行了初步研究，分离鉴定了10株胸膜肺炎放线杆菌，为高热综合征的控制和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料 2010年9月至2012年5月，从宿豫区发生高热综合征的56个猪场共采集猪病料142份，其中肺50份、关节液30份、心血40份、脑8份、脾脏6份、淋巴结5份和浓汁3份。

1.2 主要试剂及仪器 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。犊牛血清自制。胰蛋白大豆琼脂(TSA)购自Difco公司。微量生化签定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均购自宝生物（大连）有限公司。凝胶成像系统、电泳仪均为Bio-Rad公司产品。PCR扩增仪为Touchgene公司产品。

1.3 分离鉴定 （1）将病料接种于含NDA和血清的TSA固体培养基，置于5%CO2，37℃培养24~48h；挑取圆形、光滑湿润、无色透明、直径1~2mm的可以菌落，进行纯培养。（2）将可以菌落的纯培养物分别接种不含NAD和血清的TSA、不含NAD単含血清的TSA的平板，观察菌落生长情况和形态大小。（3）将可疑菌落的纯培养物接种生化鉴定管，生化鉴定管中同时加入5ml0.01%的NAD和5ml血清，置于37℃、5%的CO2培养基，培养48h观察结果。（4）PCR鉴定：参照华中农业大学陈凡硕士论文，根据APP apx IV(No.gi: 6671147)序列设计引物，PCR扩增的产物为377bp大小的片段，引物由上海生工公司合成。上游引物5'-GCTCACGAACGTTT-GCTCAT-3'，下游引物5'-GGGGACGTAA CTCGGT-GATT-3'，反应体系(50ml）：10×缓冲液50ml，2mmol/L dNTPs 1ml，10umol/ L/L上下游引物各1ml，灭菌ddH2O40ml。反应条件：94℃ 1min，59℃1min，72℃30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果

2.1 培养特性与镜检 在加有血清和NAD的TSA培养基上24h长成半透明菌落，针尖大小，直径1~2mm,侧对光线有虹光。在不含NAD和血清的TSA培养基、不含NAD但含血清的TSA培养基上均不能生长。表明分离的菌株具有NAD依赖性。在血小板上48h长成针尖大小的半透明菌落，多散在，少量短链状或长链状。

2.2 生化实验 生化实验结果表明，分离的可疑菌脲酶试验阳性，CAMP试验阳性，糖发酵试验结果为木糖阳性、葡萄糖阳性、甘露醇阳性、蔗糖阳性、阿拉伯糖阳性、乳糖阴性。

2.3 PCR鉴定 对上述经鉴定的10株可疑菌进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，证实大小均与预期大小一致。

3 讨论

本试验从大量临床病料中分离到10株胸膜肺炎放线杆菌，分离率较低，究其原因，一是近年来呼吸道症状日益突出，病原复杂，胸膜肺炎放线杆菌的因素只是其一；二是胸膜肺炎放线杆菌较难分离；三是绝大部分临床病料都是经过抗生素治疗，降低了分离效率。因此分离细菌性病原应选取发病初期、症状典型且未经抗生素治疗的病例，并且使用合适的培养基、科学的分离鉴定方法，才能客观真实地反映感染情况，提高分离效率。

（2012–11–11）

S853..61+2

B

1007-1733(2012)12-0105-02