鸡大肠杆菌区域性实时药敏动态检测

陶新萍 （山东省昌乐县红河镇畜牧兽医站 262411） 刘恩昌 （山东省昌乐县畜牧兽医局）



鸡大肠杆菌区域性实时药敏动态检测

陶新萍 （山东省昌乐县红河镇畜牧兽医站 262411） 刘恩昌 （山东省昌乐县畜牧兽医局）

本试验采集了泰安及周边地区疑似大肠杆菌病、死鸡的肝脏、心脏等样品63份，按照不同时间段将其分成3组。经过细菌分离培养、染色镜检、生化试验鉴定证明均为致病性大肠杆菌。按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS)的判定标准，对分离得到的63株大肠杆菌对12种常用抗生素进行药敏试验，结果表明，63株病菌对常用抗生素表现出不同程度的耐药性，耐药范围较广，不同菌株间存有较大差异，但该地区大多数菌株对克林沙星、丁胺卡那霉素高敏，而磷霉素钠和头孢噻肟产生了广泛耐药性。不同时间段分离菌的耐药结果变化不大。

大肠杆菌病 流行病学调查 药敏试验 耐药性

埃希菌(Escherichia coli)俗称大肠杆菌(E.coli)，是埃希氏菌属中最重要的一种细菌，属于革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，一些特殊血清型的大肠杆菌对动物有致病性[1]，如某些致病性大肠杆菌能引起禽严重腹泻、蜂窝织炎、肿头综合征、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、脐带炎、眼炎、纤维蛋白性心包炎和败血症等，给养鸡业带来严重的经济损失[2]。近30年来，随着我国规模化养鸡业的快速发展，禽大肠杆菌性疾病的危害越来越重，鸡大肠杆菌已成为最严重的病原菌之一[3]，尤其是近年来抗生素在养鸡业的无节制、不规范的大量应用，多重耐药菌株广为流行，使鸡大肠杆菌病防不胜防。为有效防治某密集养殖地区的鸡大肠杆菌病，特进行了鸡大肠杆菌区域性实时药敏动态检测及高效药物研发的研究。

肠杆菌的耐药率大幅度上升，多重耐药菌株剧增，耐药谱增宽。对硫酸新霉素、氯霉素、四环素、强力霉素、氨苄青霉素、麦迪霉素、吡哌酸的耐药率最高；对庆大霉素、卡那霉素有中等敏感性；对呋喃妥因、多粘菌素B的耐药性最低。近年来，微生物对大多数喹诺酮类药物的耐药率达10%以上，我国部分地区耐药大肠杆菌比率高达40%以上。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 培养皿，电子天平，高压蒸汽灭菌锅，试管，恒温箱，冰箱，剪刀，接种环，酒精灯，无菌操作台等。

1.1.2 试剂 药敏试纸片(丁安卡那霉素、硫酸新霉素、盐酸克林沙星、左旋氧氟沙星、乳酸恩诺、氟苯尼考、粘杆菌素、磷霉素纳、头孢哌舒、头孢曲松、头孢噻肟、阿莫西林)、麦康凯培养基、葡萄糖、乳糖、甘露醇、枸橼酸盐、V-P试验、普通琼脂、革兰氏染色液等。

1.1.3 病料 2012年4~6月自泰安及周边地区兽医门诊63例病死鸡和病残鸡的肝脏和心脏分离病菌。

1.2 方法

1.2.1 麦康凯培养基的制备 称取52.00g麦康凯培养基倒入锥形瓶中，加800ml去离子水,用电炉微热,玻棒搅拌,使其完全溶解,最后定容至1000ml。将锥形瓶及培养皿洗好、晾干的培养皿包好，放入高压蒸汽灭菌锅进行高压灭菌15min。灭菌后,倒入平皿(厚度3mm),冷却后,倒置,放入4℃冰箱备用[4]。

1.2.2 细菌的分离培养 无菌采集病、濒死鸡的肝脏接种于麦康凯琼脂培养基，放于37℃恒温箱培养24h。

1.2.3 细菌染色、镜检 无菌从肝脏或心脏取病料直接涂片，染色(草酸铵结晶紫1~2min，水洗；革兰氏碘液媒染1~3min，水洗；95%~96%酒精脱色20~30s，1min水洗；加稀释复红染10~30s，水洗；吸干)，显微镜观察。

1.2.4 生化试验 将纯化菌株分别接种于葡萄糖、甘露醇、靛基质等生化鉴定管中，放于37℃恒温箱培养过夜。

1.2.5 药敏试验 将收集大肠杆菌按时间分为3组：4.7~4.26为第1组26株，4.27~5.16为第2组21株，5.17~6.7为第3组16株。

无菌操作勾取大肠杆菌纯培养菌落以划线方式致密而均匀地涂布于普通琼脂培养基表面。再用无菌尖头镊子摄取各种抗菌素药敏试纸片，按一定密度分别贴到上述己涂布细菌的培养基表面。将贴好药敏试纸片的平板翻转，底部向上，置37℃恒温箱内培养18h，取出观察结果，并测定抑菌圈直径，作好记录。

2 结果

2.1 菌落形态

在麦康凯培养基上生长成光滑湿润粉红色圆形菌落；在普通平板培养基上生长成突起、湿润乳白色圆形菌落。所分离的细菌均为革兰氏阴性、两端钝圆的短小杆菌。

2.2 生化结果

所分离的细菌均能分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，产酸产气，甲基红试验、硝酸盐还原试验、靛基质试验均为阳性，V.P均为阴性，均不能利用柠檬酸盐，均能在三糖铁培养基中生长，产酸产气。

2.3 药敏试验

判定标准按抑菌圈直径大小作为敏感性高低的标准。抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径大于20.1mm的为高度敏感；直径在15.1~ 20.0mm者为中度敏感；直径在6.0~15.0mm者为低度敏感或耐药[5]。

2.3.1 第1组 对克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、头孢曲松、头孢哌舒、硫酸新霉素高度敏感的大肠杆菌也较多，粘杆菌素、左旋氧氟沙星中度敏感，而对头孢噻肟、磷霉素钠、乳酸恩诺耐药性较强。

2.3.2 第2组 对克林沙星、丁胺卡那霉素、头孢曲松高度敏感，粘杆菌素、左旋氧氟沙星、头孢哌舒、氟苯尼考中度敏感，而对头孢噻肟、磷霉素钠、乳酸恩诺耐药性较强。

2.3.3 第3组 对克林沙星高度敏感，丁胺卡那霉素、左旋氧氟沙星、硫酸新霉素高度敏感的大肠杆菌也较多，粘杆菌素、阿莫西林、头孢曲松中度敏感，而对头孢噻肟、磷霉素钠、乳酸恩诺、氟苯尼考耐药性较强。

3 讨论

表1表明大肠杆菌对克林沙星高度敏感，敏感率达60.32%，对丁胺卡那霉素、硫酸新霉素、头孢曲松高度敏感率较高，分别是41.27%、28.57%、34.92%。对粘杆菌素、左旋氧氟沙星中度敏感分别是52.38%、31.75%。大肠杆菌对克林沙星最敏感为79.37%，对丁胺卡那霉素、头孢曲松、粘杆菌素、硫酸新霉素也敏感，对头孢噻肟、磷霉素钠、乳酸恩诺耐药性较高，药物敏感率为9.53%、6.35%。

表1 泰安及周边地区大肠杆菌分离菌药物敏感率 (%)

对比发现大肠杆菌对药物的敏感性在不断地变化，但是大部分的药物敏感性变化不大，克林沙星对大肠杆菌一直保持高度敏感，而硫酸新霉素、头孢曲松、左旋氧氟沙星则敏感性变化较大，对磷霉素钠、头孢噻肟耐药性较高。因此，及时实时动态检测大肠杆菌对药物敏感性，有利于研发高效抗菌药物，对治疗和预防大肠杆菌具有重要的实践意义。

[1] 胡仕凤, 雷红宇, 宁玲忠. 鸡大肠埃希菌病的诊断与防治[J]. 养禽与禽病防治, 2005. 5-15.

[2] 周霞, 王静梅, 马贵军. 鸡大肠埃希菌的分离鉴定及免疫预防[J]. 上海畜牧兽医通讯. 2005. 42-43.

[3] 陈溥言主编. 兽医传染病学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2008.

[4] 陈天寿主编. 微生物培养基的制备与应用[M]. 北京: 中国农业出版社, 1995.

[5] 姚火春主编. 兽医微生物学实验指导[M]. 北京: 中国农业出版社, 2002.

（2012–07–12）

S852.61+2

A

1007-1733(2012)12-0013-02