EML4-ALK融合基因在非小细胞肺癌中的研究进展

华红伟综述 丁 罡审校

棘皮动物微管结合样蛋白4(echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4)与间变淋巴瘤激酶(anaplastie lymphoma kinase，ALK)融合基因EML4-ALK是非小细胞肺癌中继EGFR突变，K-ras突变后又一特异性分子标记物，近些年来引起了高度重视，有望成为NSCLC新的靶点。本文就EML4-ALK融合基因的发现和检测，生物学特性，EML4-ALK抑制剂的应用等综述如下。

1 EML4-ALK的发现及生物学特征

1.1 EML4-ALK的发现及亚型

EML4-ALK是NSCLC中最新发现的1种癌基因。EML4是棘皮动物微管相关蛋白样蛋白质家族成员［1］，它包括一个N-端基本区，一个疏水的棘皮动物微管相关蛋白样蛋白域和WD重复区。ALK首先在间变性大细胞淋巴瘤中被发现，作为一个核磷蛋白的融合者，伴随一个t(2;5)染色体重排［2］。EML4-ALK融合基因最初是在2007年由Soda等［3］首先发现的，他们从1例62岁吸烟的肺腺癌患者的肿瘤组织中扩增出由3，926 bp组成的DNA片段，该片段可以编码一个由1 059个氨基酸组成的蛋白质。该蛋白质的N末端是由人类EML4基因编码蛋白的一部分，而羧基端是人类ALK基因编码的胞内络氨酸激酶信号受体。EML4一ALK融合基因由第2号染色体短臂插入引起(包括2p21和2p23)，由ALK基因的3'端与EML4基因的5'倒位融合形成。以EML4的这部分区域代替ALK的包外区和跨膜控制区将导致ALK激活酶控制区特定的二聚化作用，以及由此产生的持续的接触反应活动，从而导致细胞的异常增殖，导致癌变。在随后的研究中，他们应用RT-PCR的方法在75例肺癌患者中提取肿瘤癌组织检测该融合基因，发现共有5例(6.7%)患者(3例腺癌，2例鳞癌)EML4-ALK融合基因表现为阳性，同时发现该基因阳性的患者与EGFR和K-ras突变阳性的患者没有重叠，并且检测了261例其他恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、胃肠道肿瘤)均未发现该融合基因。因此，该融合基因很有可能是非小细胞肺癌的一个新的特异性基因靶点。

研究发现，该染色体倒置并不总是发生在相同的部位，目前已发现多个EML4-ALK变异亚群。包括亚型3(E6;A20)［4］、亚型 4(E15;A20)，亚型 5(E2;A20)［5］，亚型 6(E18;A20)，亚型7(E14;A20)［6］等，其中，最常见的变异位点为 E13;A20(存在于NSCLC细胞株H3122和DFCI032中)及E6a/b;A20(存在于NSCLC细胞株H2228)，分别被成为变异1和变异3a/b，在非小细胞肺癌中分别占33%和29%［7］。所有的亚型都含有ALK胞内酪氨酸激酶结构域，始于编码外显子20的位置。这些亚群是否具有不同的临床意义还有待进一步研究。

1.2 EML4-ALK融合基因在NSCLC中的发生率及临床生物学特征

研究表明，EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中阳性比例较低。Solomon等［8］发现不加选择的NSCLC患者EML4-ALK融合基因总发生率为0.4% ～13.5%，这部分患者多为非吸烟者，且大多数是肺腺癌。2009年Wong等［9］对266例手术切除的原发性肺癌患者的标本进行了检测，在13例NSCLC患者(4.9%)标本中检出了融合基因，并发现融合基因更易发生于不吸烟、年轻以及EGFR，K-ras野生型的肺癌患者。Shaw等［10］为提高融合基因的阳性率，他们以女性、亚裔、轻度或者不吸烟的腺癌中至少符合2项为标准，挑选了141例NSCLC，使用荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH技术)检测 EML4-ALK、EGFR以及K-ras突变情况。结果表明，13%(19例)患者为EML4-ALK阳性，上述3种突变没有重叠。与EGFR突变(31例)和EGFR、ALK突变均阴性的野生型(91例)相比，EML4-ALK阳性的患者更年轻(P ＜0.001)，多为男性(P=0.036)，轻度或者不吸烟(P＜0.001)，这些临床特征有助于EML4-ALK的识别和肺癌的早期诊断。为了更好地了解中国人群中该融合基因的表达情况，Zhang等［11］在103例非小细胞肺癌中将RACE偶联PCR测序技术(RACE-coupled PCR sequencing)检测ALK融合基因的频率，发现中国的非选择性NSCLC患者中该融合基因的发生率为11.6%，但肺腺癌患者可升至19.2%，从不吸烟者为19.2%，EGFR和K-ras均为野生型的肺腺癌患者则高达42.8%。该研究表明，EML4-ALK融合基因与以下3个因素有关:无吸烟史(P=0.03)，年纪较轻初发者(P=0.03)，无 EGFR/KRAS突变的肺腺癌(P=0.04)。并且，EML4-ALK融合基因阳性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于该融合基因阴性的患者，但是EML4的表达在EML4-ALK融合基因阴性组与阳性组中无差别，因此EML4-ALK融合基因可能与ALK的的表达水平有着密切的关系。2010年，Sun等［12］对东亚地区非吸烟肺腺癌中的突变基因进行研究。分析从单一群体中(复旦大学附属上海肿瘤医院，中国上海)切除的52例无吸烟史的肺腺癌并发的基因突变:KRAS，NRAS，HRAS，HER2，BRAF，ALK，PIK3CA，TP53和LKB1。结果发现41例肿瘤存在EGFR突变，3例存在EML4-ALK融合基因，2例存在FER2插入，1例存在KRAS突变。BRAF，NRAS，HRAS，LKB1突变未被发现。此项研究是首个对一大群东亚地区无吸烟史的肺腺癌患者全面且同步地分析主要致瘤突变的研究，进行突变预测试验对于个体化的靶向治疗有重要的指导意义。

既往的研究［3，11］认为 EGFR突变与 EML4-ALK突变不共存，EML4-ALK融合型基因可能是继KRAS之后的EGFR对TKI耐药的另外一个原因。随着研究的深入，临床发现了EGFR突变与EML4-ALK突变同时存在的病例，如Tiseo等［13］报道了1例同时具有EGFR突变和EML4-ALK突变的病例，该患者是1例48岁无吸烟史的高加索男性患者，使用EGFR-TKIs(厄洛替尼)治疗未有临床益处。而Kuo等［14］报道了1例72岁的非吸烟女性肺腺癌患者，该患者同时具有EGFR突变和EML4-ALK突变但使用EGFR-TKIs(吉非替尼)却有临床效果。因此，当患者存在EML4-ALK融合基因时，还应仔细检测是否存在EGFR突变，对同时存在EGFR突变和EML4-ALK突变的肺癌的临床生物学特征和最佳治疗方案还有待进一步研究。

2 EML4-ALK的检测方法

在临床实践中已使用多种技术来检测EML4-ALK融合基因，包括PCR技术(polymerase chain reaction)，免疫组化技术(immunohistochemistry，IHC)，荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridsation，FISH)等。但是，目前还没有标准方法来检测非小细胞肺癌中的EML4-ALK融合基因。

2.1 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)

RT-PCR可能是检测NSCLC中ALK融合基因的有效手段，该技术灵敏度较高，检测到基因扩增产物则暗示着ALK的重排。但是，RT-PCR分析基于单管多重技术(muitiplex)，不能检测EML4-ALK融合基因的未知亚型，其对引物的要求较高，并且检测甲醛固定的石蜡包埋切片，RNA易大量降解而降低其灵敏性。另外，有证据表明RT-PCR检测EML4-ALK可能会扩大假阳性［15］，即肿瘤组织和非肿瘤组织中都会出现ALK的重排。尽管RT-PCR有以上缺点，但仍然提倡使用RT-PCR的方法检测EML4-ALK的融合基因。

2.2 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)

FISH是检测ALK融合基因更加特异的方法，该分析方法在ALK基因断裂点的对侧使用2种不同的被标记探针，正常的ALK出现黄色标记，融合的ALK则表现红色和绿色［16］。由于在应用FISH技术时，要用到甲醛固定，石蜡包埋等，这些技术会对组织形态造成破坏，因此尽管FISH是1种检测肺腺癌中ALK重排的灵敏而独特的手段，却并不完全可靠。最新的一项研究表明［17］，1例ALK重排的肺腺癌利用免疫组化技术来检测检测ALK蛋白表达时，在使用FISH分析时误诊为ALK野生型。并且，FISH不能检测不同种类的EML4-ALK融合。FISH现在用于PF-02341066(Crizotinib)的临床试验中，以≥15%的分离细胞核作为诊断ALK融合基因的标准。

2.3 免疫组织化学技术(immunohistochemistry，IHC)

IHC技术分析FFPE组织是当前外科病理实践的主要方法，该方法的优点是可以在不损失用于鉴别正常与病理组织的细胞形态和结构特点的情况下检测肿瘤特异性抗原的表达。几种人类ALK蛋白的特异性抗体已经形成，并且有些经过IHC试验，已广泛地应用于诊断 ALK融合的渐变性大细胞瘤(ALCL)［18］。

Mino-Kenudson等［19］报道了1项关于IHC的实验，该实验使用提高FFPE中ALK蛋白表达灵敏性和特异性的抗体来分析174例肿瘤。通过试验发现在22例ALK融合的肺腺癌患者中都表达了ALK蛋白，而在131例ALK为野生型的肺腺癌患者中未发现该蛋白。ALK融合的肺腺癌中ALK蛋白的表达水平比ALK融合的ALCL低，并且22例中的13例(59%)只有使用新式高灵敏度的IHC试验才可以被检测出。这些发现表明在ALK融合的肺癌中ALK的表达是受到限制的。这为在临床病理医生使用IHC试验诊断适合ALK靶向治疗的患者提供了可能性。但是存在ALK融合的组织中，即使使用最高灵敏度的IHC实验，在活组织切片中其染色也可能不明显，在这种情况下应该考虑FISH技术作进一步确认。

尽管在全球临床实验室中用IHC技术诊断ALK融合的ALCL，但是该技术并不能发现大多数ALK融合的肺腺癌，这是由于与ALK融合的ALAL相比，在ALK融合的非小细胞肺癌中ALK表达水平较低。为了克服这种限制，Takeuchi等［6］建立了1种插入式抗体强化聚合物(intercalated antibody-enhanced polymer，iAEP)方法，在ALK抗体和葡聚糖聚合物检测试剂之间合并一个插入抗体。结果表明在免疫组化介导的EML4-ALK检测中，使用 iAEP，在所有的 NSCLC样本中均发现了已知的EML4-ALK阳性肿瘤。并且还发现了新的EML4-ALK亚型(亚型6(E18;A20)，亚型7(E14;A20))和一个新的ALK融合基因KIF5B-ALK。

目前还没有公认的检测EML4-ALK融合基因的金标准，上述的技术都各有优缺点，如何有效利用各种检测分析技术简单有效地检测出该如何基因还有待进一步研究。

3 ALK抑制剂的使用

先前的研究发现在EML4-ALK融合基因阳性的肺癌中ALK的mRNA水平要高于该融合基因阴性的患者，因此抑制ALK激酶可能是临床1种有效的治疗方法［3］。临床前研究表明，应用ALK抑制剂治疗EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC时，关键性的信号传导通路下调并出现细胞凋亡［20，21］。这与EGFR L858R突变NSCLC细胞株H3255使用EGFR抑制剂吉非替尼时观察的结果相类似［22］。ALK抑制剂在体内试验中的疗效也得到评估，在由EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC细胞株产生的异种移植物模型中应用ALK抑制剂也可导致细胞的凋亡或者肿瘤的衰退缩减［23，24］。

PF-02341066(crizotinib)是口服的小分子ALK抑制剂，CrizotinibⅠ期临床试验开始于2006年5月。当发现EML4-ALK融合基因以及PF-02341066可以抑制ALK后，参与该临床实验的包括MET突变或者ALK14突变的患者。Kwak等［25］从1 500例NSCLC患者中发现82例(5.5%)携带1个ALK重排，在这些患者中使用1种新型的ALK激酶抑制剂:crizotinib(PF-02341066)进行临床试验。在平均治疗时间为6.4个月中，该药物有效率达57%(47/82)，46例部分缓解和1例完全缓解，27例病情稳定，该药的副作用主要是轻度的胃肠道反应。该研究结果首次在2009年ASCL大会上报告。鉴于PF-02341066较高的有效率和较好的安全性，该药被批准直接进入Ⅲ期临床试验，即使用crizotinib单药与标准的二线化疗(培美曲赛或多西紫杉醇)治疗EML4-ALK阳性NSCLC随机三期试验;同时，不符合进入Ⅲ期临床研究的EML4一ALK阳性NSCLC患者接受PF-0234561066单药治疗的Ⅱ期临床研究。2011年ASCO对Crizotinib的I期临床试验结果进行了更新［26］，119例NSCLC患者使用PF-02341066治疗时，中位无进展生存期达到10个月(95%CI:8.2 ～14.7)，客观有效率为 61%(95%CI:52% ～70%)，中位有效应答时间为48 w，中位生存时间达1年的概率为81%。但是，Tanizaki等［27］发现尽管大多数EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC能从ALK抑制剂获益，但是该药物的疗效在不同个体中有很大差别。在融合基因阳性的H3122细胞株中，ALK抑制剂TAE684通过抑制STAT3和ERK的磷酸化作用来抑制细胞的增殖，从而诱导细胞凋亡。在融合基因阳性的H2228细胞株中，TAE684只能抑制STAT3磷酸化，而不能抑制ERK磷酸化，对于细胞的增殖或者凋亡基本没有影响，而MEK抑制剂可以联合抑制STAT3和ERK通路从而诱导凋亡，因此，联合使用TAE684和MEK抑制剂，对于STST3和ERK通路可以起到双重抑制作用，从而下调抗凋亡蛋白存活素，上调促凋亡蛋白的表达。

4 ALK抑制剂的耐药问题

随着药物的应用和研究的深入，ALK抑制剂将不可避免地出现耐药性。Choi等［28］报道了1例EML4-ALK阳性的28岁非吸烟的男性NSCLC患者，在成功接受Crizotinib治疗5个月后对该药产生耐药，并且研究者在该患者中发现两处新的突变，即4374G→A和4493C→A。2个碱基突变分别导致了氨基酸C1156Y和L1196M的改变，从而影响ALK与Crizotinib或ATP的结合，并且L1196M突变导致的耐药性比 C1156Y更强。Zhang等运用加速突变基因的策略来检测对Crizotinib耐药的ALK突变，应用体外基因扫描技术成功地检测出L1196M，C1156Y和F1174L的改变，并且研究者使用1种更有效的ALK抑制剂TAE684来克服Crizotinib产生的耐药［29］。最近，有研究表明 另 外 3 种 ALK 抑 制 剂 AP26113［30］，CH5424802［31］，X-396［32］都能选择性地抑制 L1196M突变导致的耐药。Ryohei Katayama等［30］为研究肿瘤细胞是如何产生耐药，运用大剂量的Crizotinib作用于EML4-ALK融合基因阳性的NSCLC的细胞系直至其产生耐药，从而建立了耐药模型，他们发现当产生耐药性以后，EML4-ALK基因扩增，高剂量抑制剂使L1196M基因发生突变从而导致耐药，在随后的研究中，他们发现了另外2种结构不同的 ALK抑制剂，NVP-TAE684和 AP26113。其中，NVPTAE684明显减少了H3122和H3122CR细胞系的存活力，这与H3122和H3122CR细胞系Crizotinib产生耐药形成了鲜明的对比。而AP26113与Crizotinib相比，其在细胞内的作用强度高于Crizotinib5倍，同时AP26113在EML4-ALK阳性或者突变的Ba/F3细胞系中都表现出高度活性。同时，在二期试验中，这些耐药细胞对于Hsp90抑制剂17-AAG高度敏感。

EML4-ALK是NSCLC中1种新的分子靶点，EML4-ALK融合基因阳性的患者具有独特的临床病理特性，近期发现的EML4-ALK融合基因与EGFR基因突变共存型患者中有许多尚未明确地问题值得研究，如不同病例对EGFR TKIs反应不一致的原因，采用何种药物对基因共存体患者进行更好地靶向治疗等。目前检测EML4-ALK融合基因的技术有多种，但是还没有1种金标准，如何应用更加灵敏准确的技术，检测出该具有该融合基因的NSCLC患者更好地进行靶向治疗是面临的挑战之一。初步的研究表明ALK抑制剂Crizotinib(PF-02341066)治疗EML4-ALK阳性的NSCLC患者疗效显著，该药物的Ⅲ期临床试验正在进行，随着药物的使用而不可避免的产生耐药性也是值得关注的问题，有关耐药的机制，耐药后患者该如何进行治疗等都需进一步研究，从而使患者更好地受益，真正实现个体化的靶向治疗。

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