脱氧雪腐镰刀菌烯醇的细胞毒性作用

武慧慧 于爱莲

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素(vomitoxin)，属于单端孢霉烯族毒素的一种，是由某些镰刀菌属产生的毒性代谢产物[1]。DON广泛存在于各种粮谷类作物及其制品中[2]，性质极为稳定，在粮食的储存和加工过程中不易被破坏，因此极易通过食物链引起人畜中毒[3]。现就 DON 的细胞毒性作用及其可能机制作一综述。

1 DON的一般毒性作用

DON虽不及同族其他毒素如T-2毒素的毒性强烈，但因其污染率和污染水平均居单端孢霉烯族毒素之首，并常与其他真菌毒素协同作用于人体，可严重威胁人类健康。DON可产生广泛的毒性效应，如急性毒性、慢性和亚慢性毒性、细胞毒性、免疫毒性等多种毒性作用[4]。此外，DON对血液系统、中枢神经系统、消化系统及钙磷代谢亦可产生影响。

2 DON的细胞毒性作用

DON具有明显的细胞毒性，它对于原核细胞、真核细胞、植物细胞和肿瘤细胞等均具有明显的毒性作用。在植物细胞中, DON的主要作用是抑制有丝分裂，降低有丝分裂指数。在动物组织中DON主要作用于增长迅速、处于分裂状态的细胞，如胃肠道细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、脾细胞、骨髓造血细胞等，所引起的损害与辐射引起的细胞损害相似[5-6]。DON的毒性作用可能是由于其抑制了肽基转移酶活性中心，并干扰了DNA连接酶的活性而影响蛋白质和DNA的合成。此外，DON还可抑制脂肪合成和磷脂摄取而损害细胞膜的功能[7]。

2.1DON对软骨细胞的毒性作用

大骨节病多发于儿童和青少年，以关节软骨、骺软骨和骺软骨板变性坏死为基本病变，真菌中毒说是大骨节病当今四大病因学说之一，流行病学调查结果显示，病区DON检出率与非病区有显著差异。因此有学者采用体外培养关节软骨细胞的方法，在培养液中加入不同剂量的DON，观察DON对软骨细胞的直接影响。超微结构观察发现，DON对体外培养的兔关节软骨细胞的膜系统和细胞器均可造成明显损伤，培养早期的软骨细胞损伤尤为严重；软骨细胞趋于成熟后, DON对其结构和功能的损伤呈剂量依赖性；DON对于完全成熟的软骨细胞则影响不大(浓度1.0～2.5 μg/ml)。这一结果符合大骨节病多发于生长发育期的少年儿童，并侵犯其未发育成熟的干髓端、髓板、骨髓、关节软骨等现象。同时测定基质内葡萄糖醛酸和细胞内DNA的含量, 发现DON可剂量依赖性的减少细胞DNA含量，明显抑制软骨细胞分裂增殖[8]。彭双清等[9]研究了DON对鸡胚软骨细胞的损伤作用，其超微结构的改变主要为软骨细胞膜系统的损伤，与前述DON对兔关节软骨细胞损伤的表现一致。给予相同剂量的同时,补充5 μg硒，可使DON对鸡胚软骨细胞的损伤程度明显减轻，可见硒对DON造成的软骨损伤有保护作用。DON 究竟是不是大骨节病的主要病因，还有待临床流行病学调查和基础医学实验等进一步探讨研究。

2.2脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肠上皮细胞的毒性作用

临床实验证明，低到中等剂量DON的急性暴露会引起受试动物的呕吐、腹泻和胃肠炎, 较高剂量则引起胃肠道黏膜上皮细胞的严重损害，造成出血、休克等[10]。经口摄入被DON污染的食物后，消化道上皮细胞便暴露在高DON浓度下，成为DON作用的主要靶点。猪是对DON毒性最为敏感的动物，用猪的肠上皮细胞系IPEC-J2为研究对象[11]，检测DON作用下细胞的存活率和培养基中LDH的活性。结果可见浓度为2.5和10 μM 的DON染毒组细胞数量明显减少，同时因细胞受损代谢减慢而导致ATP含量明显减少，培养基中LDH的释放量显著增加。LDH是糖酵解过程中的关键酶，当细胞膜受损伤时便会逸出细胞外，使培养基中LDH活性增加。DON浓度为10 μM时，镜下可见细胞形态的明显改变，包括细胞变圆、溶解和脱落。说明DON确对消化道上皮细胞有直接毒性作用。

2.3脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肝细胞的毒性作用

Mikami 等[12]将不同浓度的DON作用于体外培养的猪肝细胞，结果发现，10 μg/ml和100 μg/ml浓度组作用6h，以及0.1，1，10，100 μg/ml浓度组作用24 h，肝细胞出现凋亡，并随DON浓度增高呈剂量依赖关系。肝细胞出现了染色质凝聚、核碎片等凋亡特有的形态学改变。DON对体外培养的人源肝细胞也有明显的细胞毒性作用[13]，可剂量依赖性地降低细胞活力、蛋白质含量和白蛋白的分泌。DON通过激活凋亡关键酶Caspase -3诱导肝细胞凋亡，并引起LDH漏出等功能紊乱表现。此外，单细胞凝胶电泳显示，DON还可引起离体培养的大鼠肝细胞DNA单链断裂，造成DNA损伤[14]。DON在粮食中广泛存在，提示人们警惕DON诱发肝脏疾病的潜在危险。

2.4脱氧雪腐镰刀菌烯醇对心肌细胞、血管内皮细胞的毒性作用

彭双清等[15]报道，DON可减小体外培养大鼠心肌细胞的动作电位、最大除极速度、超射 (OS) 及阈电位，从而改变心肌细胞的去极化过程。除OS在DON为50 mg/ L时增高外，其余参数均存在明显的剂量效应关系。其次，复极化过程也发生了改变，表现为DON可明显延长复极化动作电位时程，减小最大舒张电位，抑制动作电位发放频率。以上两点表明DON可抑制大鼠心肌细胞的跨膜电位，用亚硒酸钠对心肌细胞进行预处理，可发现DON对其动作电位的抑制作用明显减弱，推测亚硒酸钠可减轻DON对心肌细胞动作电位的影响，呈现明显的保护作用。

血管内皮细胞形成血管光滑的内壁,在调节血压、创伤修复、止血、血栓形成等一系列生理病理过程中起重要作用。将不同浓度的DON分别作用于猪髋动脉内皮细胞(PIEC) 和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)各24 h[16]，镜下可见高浓度DON可使PIEC细胞贴壁数目减少，细胞界限不清，HUVEC细胞则变圆皱缩，形态均发生明显变化。各浓度组DON均可对此两种细胞产生增殖抑制作用，相同浓度的DON对PIEC的增殖抑制作用强于对HUVEC的增殖抑制作用,这可能与临床上猪对DON的高敏感性有关。DON可诱导此两种细胞发生凋亡，当DON浓度为0.5 mg/L 时, PIEC细胞的凋亡率达到最高；而当DON浓度为5 mg/L时, HUVEC细胞凋亡率达到最高。此后凋亡率随浓度的升高而下降，这可能是由于凋亡细胞崩解脱离细胞片引起的。DON诱导PIEC细胞凋亡可能与Caspase-9途径和促凋亡因子Bax有关，而在其诱导HUVEC细胞凋亡的过程中，Caspase-9和Bax 的变化未被检测到。以上两点可以推测，长期慢性暴露于DON污染的粮食及其制成品，可能会造成心肌电生理紊乱和血管内皮细胞损伤，从而导致心脑血管疾病。

2.5脱氧雪腐镰刀菌烯醇对肾细胞的毒性作用

Dinu 等[17]发现人胚肾细胞Hek-293的存活率随DON剂量的增加而降低，IC50大约为7.6 μM。5 μm DON作用24 h, 可见细胞形态变圆，细胞器减少，Caspase-3表达量未见变化，Bcl-2表达量下调，细胞本身的抗氧化系统不能有效对抗DON的作用。应用彗星实验观察DON 对非洲绿猴肾细胞(Vero 细胞)的DNA损伤与修复的影响, 可见细胞受损数量和DNA 损伤程度随染毒剂量和时间的增加而加重[18]。短时间染毒，损伤主要表现为DNA碎片的增加，较长时间染毒，则主要表现为DNA碎片变小。去除DON, 重新孵育若干时间，受损细胞能够进行自我修复, 短时间染毒(4 h) 需要的修复启动时间较短(<15 min) , 而长时间染毒(16 h) 需要的修复启动时间则相应较长(>15 min)，可见，DON毒素可致Vero细胞DNA损伤，但这种损伤是直接性的，还是通过膜或代谢作用间接造成的, 其具体的机制仍需进一步探讨 。

2.6脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠胚胎干细胞的毒性作用

本实验室吴萍等[19]采用饲养层培养法体外培养小鼠胚胎干细胞(mES)，待其生长至对数期，加入不同浓度的DON作用24 h，观察DON对ES细胞的毒性作用。检测结果可见DON能抑制mES细胞的生长，影响细胞周期的分布，抑制细胞进入S期，使细胞停滞在G0/G1期，具有明显的抗增殖作用。SSEA-1、Oct-4、Nanog是mES细胞的特异基因，DON作用于mES细胞可增加SSEA-1表达量，降低Oct-4、Nanog基因表达量，从而影响mES细胞的分化和发育。同时，DON在低浓度(10 ng/ml)时即可使NICD以及Jag-1、 Hes-1表达明显减少，说明DON能够抑制Notch信号通路的转导，进而影响mES细胞的增殖及分化等。

2.7脱氧雪腐镰刀菌烯醇对免疫细胞的毒性作用

近年来，DON对免疫细胞的毒性研究逐渐增多。DON可诱导并促进免疫细胞凋亡、抑制其增殖，一些刺激因素如LPS可明显增强其诱导凋亡抑制增殖的作用。从细胞凋亡与增殖的角度分析，DON主要表现为一种免疫抑制作用[20]。DON还可影响免疫细胞因子的分泌，根据DON浓度和作用时间的长短，DON对免疫细胞因子的作用既可表现为抑制又可表现为超诱导[21]。

李月红等[22]研究了DON对小鼠胸腺细胞凋亡和增殖的影响。FCM结果显示，各浓度组胸腺细胞的凋亡率均明显高于对照组，其中4 mg/kg 和8 mg/kg DON处理组，S期和G2～M期的比例降低，且DNA琼脂糖凝胶电泳出现了凋亡特有的DNA“ladder”，提示高浓度DON可明显抑制小鼠胸腺细胞增殖。透射电镜观察DON处理过的胸腺细胞，可见核固缩、胞质空泡化等凋亡表现。4 mg/kg 和8 mg/kg DON处理组细胞甚至出现了胞核溶解消失、胞膜破裂等变性坏死的表现。王会艳等[23]以流式细胞仪DNA含量分析和DNA琼脂糖凝胶电泳方法研究了DON对人淋巴细胞凋亡的影响。浓度分别为50，100，200，500，1000，2000 μg/L 的DON处理2～72小时，经流式细胞术检测各实验组淋巴细胞均出现了典型的亚二倍体凋亡细胞峰，凋亡百分率与毒素作用剂量和时间呈正相关。DON浓度为1000 μg/ L，处理24 h， DNA琼脂糖凝胶电泳结果可见特征性的DNA“Ladder”条带。据此，DON可诱导体外培养的人外周血淋巴细胞产生凋亡。

Islam等[24]研究了细菌脂多糖 ( LPS) 和 DON 联合应用对小鼠胸腺 T细胞亚群、集合淋巴结和骨髓B细胞亚群凋亡诱导的影响。流式细胞定量分析表明, 两者联合处理12 h 可明显促进胸腺内非成熟的 CD4-CD8-/ CD4+CD8+T淋巴细胞和成熟的CD4-CD8+T淋巴细胞凋亡的发生, 24 h后检测到各群细胞数均减少，同时集合淋巴结成熟B淋巴细胞和骨髓成熟B淋巴细胞及前B淋巴细胞也发生明显的凋亡。进一步研究发现, 糖皮质激素受体拮抗剂 RU486 可阻断 LPS 和 DON 联合诱导的上述各亚群淋巴细胞的凋亡, 有效保护细胞的减少。综合分析提示, LPS 和 DON 联合诱导淋巴细胞凋亡是通过糖皮质激素介导的。

2.8脱氧雪腐镰刀菌烯醇对胃癌细胞的毒性作用

DON不仅对正常细胞有毒性作用，对于肿瘤细胞亦有影响。有报道称，DON可引起直接的DNA损伤，并通过细胞凋亡程序激活P53和Caspase-3从而诱导HT29(人类结肠癌细胞株)发生凋亡。邢欣等[25]将浓度分别为0，500，1 000 μg/L的DON分别作用于体外培养的胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823，结果显示DON可明显抑制两株细胞的增殖活性，且随DON浓度增加，抑制率逐渐增高。DON抑制胃癌细胞增殖的机制包括：G2/M期阻滞、P21WAF/CIP1表达增高及细胞周期蛋白E表达下降。DON对分化程度不同的胃癌细胞的影响没有明显差别。又有研究[26]报道，DON可引起SGC-7901、BGC-823细胞发生凋亡，但凋亡率明显低于正常细胞，提示DON的毒性存在细胞类型差异。DON诱导此两种胃癌细胞凋亡的主要途径是上调细胞内Bax蛋白表达量，同时下调Bcl-2蛋白表达量。

3 结 论

DON 在各种粮谷类作物中广泛存在，其细胞毒性已经引起了各国研究者的重视。综合目前的研究结果来看, DON 的细胞毒性作用主要表现为以下几个方面: (1)DON的细胞毒性非常广泛，对正常细胞和肿瘤细胞均可产生毒性作用。(2) DON的毒性效应存在物种来源和细胞类型的差异，作用机制亦有差别。(3) DON的细胞毒性作用主要是抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，且其毒性作用有时间和剂量的依赖性。目前, DON 的细胞毒性作用多集中在损伤现象的研究, 今后的研究方向应当包括以下几个方面: (1)进一步研究 DON 的细胞毒性作用机制及其通路，同时进行更为广泛的流行病学研究，证明DON污染与人类疾病之间的关系。(2)加强对多种真菌毒素联合作用的关注。(3) 加强粮谷作物防霉技术、DON降解和去除技术的研究及专业技术人才的培养，以期为防治DON提供技术支持。

[1] Kushiro M．Effects of Milling and Cooking Processes on the Deoxynivalenol Content in Wheat[J]．Int J Mol Sci， 2008,9:2127-2145.

[2] Yazar S,Omurtag G.Fumonisins, Trichothecenes and Zearalenone in Cereals[J].Int J Mol Sci，2008,9:2062-2090.

[3] 李群伟．真菌毒素与人类健康[M]．北京：人民军医出版社，2005:86-96.

[4] 朱小明, 于爱莲. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性作用研究进展[J]. 医学综述, 2010, 16(9):1294-1296.

[5] 霍兴华，赵宝玉，万学攀,等．脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性研究进展[J]．毒理学杂志, 2008, 22(2): 151-154.

[6] Harvey RB，Kubena LF，Huff WE，et al．Hematologic and immunologic toxicity ofdeoxynivalenol(DON)-contaminated diets to growing chickens[J]．Bull Environ Contam Toxico，1991, 46 (3):410-416.

[7] 李东华，罗雪云．脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性研究进展[J]．中国食品卫生杂志，1991, 16(4):13-17.

[8] 曹峻岭, 莫晓燕．脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)对培养软骨细胞生长代谢的影响[J] .中国地方病防治杂志，1993, 12(5):275-277.

[9] 彭双清, 遇秀玲, 汪宝珍,等. 脱氧雪腐镰刀菌素烯醇(DON) 致鸡胚软骨细胞损伤及硒的保护效应[J].中国地方病学杂志, 1994, 13 (2) : 80-82.

[10] James J，Pestka K．Deoxynivalenol: Toxicity，mechanisms and animal health risks[J]．Animal Feed Science and Technology, 2007，37: 283-298.

[11] Awad WA, Aschenbach JR, Zentek J，et al . Cytotoxicity and metabolic stress induced by deoxynivalenol in the porcine intestinal IPEC-J2 cell line[J]．J Anim Physiol Anim Nutr (Berl)，2011,27:453.

[12] Mikami O, Yamamoto S, Yamanaka N, et al ．Porcine hepatocyte apoptosis and reduction of albumin secretion induced by deoxynivalenol [J] . Toxicology, 2004, 204 (2-3) : 241-249.

[13] Königs M , schwerdt G．Effects of the mycotoxin deoxynivalenol on human primary hepatocytes[J]．Mol Nutr Food Res，2008,52(7):830-839．

[14] 李斌, 郭卫红．AFB1 和DON 对大鼠原代肝细胞DNA 损伤的研究 [J]. 中国公共卫生, 2001, 17 (12) : 1115-1116.

[15] 彭双清, 杨进生. 镰刀菌毒素 DON 对心肌细胞膜电位的影响及硒的保护效应 [J]. 中华预防医学杂志, 2003, 37(6) : 423-425.

[16] 刘秀芳,张爱华,张洪英,等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇诱导血管内皮细胞凋亡及其凋亡相关因子的初步研究[J].畜牧兽医学报, 2008, 39(6): 778-783.

[17] Dinu D，Bodea Go.Adapted response of the antioxidant defense system to oxidative stress induced by deoxynivalenol in Hek-293 cells[J]． Toxicon，2011, 57(7-8)：1023-1032．

[18] 林林,孙树秋.脱氧雪腐镰刀菌烯醇致Vero细胞核基因组DNA损伤与修复的彗星实验观察[J].中国地方病防治杂志，2004, 19(3): 139-141.

[19] 吴萍，于爱莲.脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠胚胎干细胞的毒性作用[D].泰安:泰山医学院，2011.

[20] 林少青，董斌．脱氧雪腐镰刀菌烯醇的免疫毒性研究进展[J]．广东饲料, 2009,18(7):43-45.

[21] Pestka JJ, Zhou HR, Moon Y, et al．Cellular and molecular mechanisms for immune modulation by deoxynivalenol and other trichothecenes: unraveling a paradox[J]. Toxicol Lett，2004,153：61-73.

[22] 李月红，张祥宏．脱氧雪腐镰刀菌烯醇对小鼠胸腺细胞凋亡和增殖的影响[J]．中国病理生理杂志，2002, 18( 7) : 778-781．

[23] 王会艳, 孙旭明, 张祥宏,等. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇、黄曲霉毒素 G 对体外培养人外周血淋巴细胞凋亡影响的研究[J].卫生研究, 1999, 28 ( 2) : 102-104.

[24] Islam Z, King LE, Fraker PJ, et al . Differential induction of Glucocorticoid-dependent apoptosis in murine lymphoid subpopulations in vivo following coexposure to lipopolysaccharide and vomitoxin (deoxynivalenol)[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2003,187(2):69-79.

[25] 邢欣,刘静,邢凌霄,等.脱氧雪腐镰刀菌烯醇对胃癌细胞增殖及细胞周期的影响[J].细胞生物学杂志, 2007, 29 (5):729-735.

[26] 刘静,邢欣,邢凌霄,等. DON对胃癌细胞HGC227细胞周期和凋亡的影响[J].肿瘤防治研究, 2007, 34(12): 897-900.