郫县豆瓣高酶活米曲霉选育鉴定及复合菌制曲改善酶系组成研究——郫县豆瓣复合菌制曲改善酶系组成研究

李 峰，赵 萍，周昌豹，谢 彪

（四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都 611130）

郫县豆瓣是以红辣椒、蚕豆为主要原料，经自然接种发酵，日晒夜露形成的独具风味的传统特色调味品。郫县豆瓣采用的是传统开放式发酵工艺，生产当中的微生物都是自然接种，郫县豆瓣发酵醅当中的微生物种类和数量受季节和气候的影响，导致郫县豆瓣品质不稳定，发酵周期长，这也制约了行业快速发展。因此如何缩短郫县豆瓣发酵周期，提高产品品质，是研究的必然趋势。

影响郫县豆瓣生产周期的生产环节是蚕豆瓣的制曲发酵和豆瓣酱的晒露。蚕豆发酵主要是利用豆瓣曲中的米曲霉产生的各种酶类进行酶解原料，产生氨基酸态氮和糖类物质及有机酸，传统发酵时间是2～3个月，晒露工艺主要是酵醅中的酵母和细菌将蚕豆酱中的氨基酸态氮、糖类物质及有机酸转化为郫县豆瓣的风味物质的过程，可见蚕豆发酵是控制发酵周期的关键环节。因此如何提高蚕豆酱中氨基酸态氮及糖类将有利于风味物质的形成，并缩短发酵时间。

目前很多生产企业已采用纯种米曲霉生产制曲，如果缩短发酵时间会导致氨基酸态氮低、风味淡薄等问题，其原因是市售曲精中的米曲霉主要是中性蛋白酶为主，酸性蛋白酶和淀粉酶活力低。本实验将使用从郫县豆瓣生产过程中筛选出的高酶活米曲霉进行复合菌制曲，提高豆瓣曲总酶活，改善豆瓣曲的酶系组成，有效提高豆瓣产品氨基酸态氮和还原糖含量，缩短发酵时间提高产品品质，解决行业的共性问题。

1 郫县豆瓣生产工艺流程

郫县豆瓣生产工艺流程图。

脱壳的蚕豆瓣除杂、浸泡后与曲精和面粉拌匀，进入制曲池制曲，成曲拌入盐水在发酵池发酵。

鲜辣椒采收后经除杂、清洗、斩拌后加入食盐，入盐渍池贮存，然后与发酵成熟的豆瓣酱混合，经晒露后，进行加工包装。

2 材料和试剂

主要原料：蚕豆、面粉、麸皮和豆粕。

实验菌株：菌种ddQ-125和jcQ-93，分离自郫县豆瓣生产企业，本实验室保存，将ddQ-125菌株标记为A，jcQ-93菌株标记为B；市售商品曲精为C，后面将以标记菌株A、B、C进行实验。

固体培养基：按照麸皮:豆粕为4:1的比例混匀，并加入干料量75%（v/w）的拌匀。121℃、0.1MPa灭菌45min。

主要试剂：福林试剂（Folin试剂）、二硝基水杨酸（DNS）试剂均为实验室自配；其他试剂均购自成都百旺化学试剂公司。

主要仪器：752型紫外可见分光光度计，HH-600（0）型电子恒温水浴锅，LXJ-II离心沉淀机，PHS-3C型精密pH计，LRH-250A型生化培养箱，XS-18型光学显微镜。

3 检测方法

3.1 酶活力测定

粗酶液制取方法：上述制得固体曲样品中按重量加入1:20（w/v）的缓冲溶液，于40℃水浴中浸提1h，间歇搅拌，过滤得粗酶液。此粗酶液用于下述各种酶活性测定。

3.1.1 蛋白酶测定方法

采用福林酚法。

3.1.2 淀粉酶测定

样品处理：酶液提取方法同蛋白酶测定，取5mL粗酶液，7000r/min离心30min，吸取上清液测定酶活性。

酶活测定方法：参照Michael Somogyi的方法进行测定。

3.1.3 氨基酸态氮的测定

样品处理：称取约20.0g已剁细的试样置于200mL烧杯中，加入100mL水，加热煮沸，冷却移入200mL容量瓶中，用少量水分次洗涤烧杯，洗液并入容量瓶，并加水至刻度，混匀，将样液过滤，滤液备用。

测定方法：采用甲醛滴定法测定样品中郫县豆瓣的氨态氮。

3.1.4 还原糖的测定

按照Miller的方法，采用DNS（二硝基水杨酸）比色法法测定郫县豆瓣样品中的还原糖。

4 实验方法

4.1 种曲培养

按照麸皮:豆粕为4:1的比例混匀，并加入干料量75%（v/w）的水，拌匀。121℃、0.1 MPa灭菌45min，冷却后分别接入菌种A、B、C，30℃恒温培养72h。

4.2 单菌种制曲

将蚕豆在95℃热水中漂烫10min 后，浸泡程度为豆肉无白心，沥干凉冷至40℃，按照蚕豆:面粉为4:1的比例混合，再接入3%种曲充分混合，摊入曲盘中品温控制在33℃～37℃，相对湿度90%，曲料结快翻曲，发酵时间72h出曲。成曲有茂盛的黄绿色孢子。

4.3 混合菌种制曲

同方法4.2，接入的菌种为A、B混合种曲。分别按A:B为2:1进行制曲，测定酶活。

4.4 保温发酵

曲瓣子与盐水按传统工艺要求的比例混合后入池进行保温发酵，水浴温度在50℃～55℃，品温在40℃～45℃，发酵周期为25d～35d成熟，制成成熟瓣子（甜瓣子）。测氨基酸态氮和还原糖。

5 结果与分析

蛋白酶的作用是将原料蚕豆及面粉中含的蛋白质，经蛋白酶分解作用，逐步降解成胨、多肽和氨基酸。有些氨基酸是呈味的，就变成豆瓣酱的风味成分。淀粉酶作用可使原料中的淀粉糖化产生葡萄糖，为曲霉、酵母菌及其他微生物提供了碳素营养，同时在豆瓣发酵阶段，淀粉酶继续将淀粉糖化，成为豆瓣的甜味成分。同时，一部分糖类作为酵母菌和乳酸菌的发酵基质转化为乙醇和有机酸，是构成成品风味的重要成分。所以，蛋白酶、淀粉酶的协同作用对豆瓣的色、香、味均有重大影响。

5.1 单菌株酶系组成

图1 单菌株的酶系组成Fig.1 Enzymes of the single strain

米曲霉所产蛋白酶，根据作用的最适pH值可以分为3类：酸性蛋白酶（最适pH值为3）、中性蛋白酶（最适pH值为7）、碱性蛋白酶（最适pH值为9～10）。一般郫县豆瓣生产用米曲霉蛋白酶中，中性蛋白酶活性较强，酸性蛋白酶活性较弱。由图1可知，菌株A酸性蛋白酶活力最强，菌株B的中性蛋白酶和淀粉酶的酶活力较菌株最强。

5.2 单菌株与复合菌种制曲过程中酶活变化

本实验考察了菌种A、B、C及AB菌种混合制曲过程中酸性、中性蛋白酶活力及淀粉酶的变化。

图2 制曲过程中性蛋白酶活性变化Fig.2 Changes of neutral protease activity during Qu making process

单菌株制曲的蛋白酶活力在60h时出现最高值，对照组产酶高峰在66h～70h，筛选出的菌株单菌株制曲的酶活力较高，菌株A酸性蛋白酶最高达1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高达3200U/g，淀粉酶活力最高达300U/g，其中菌株B的总酶活为4300U/g，复合菌制曲其总酶活力高达4550U/g，且3种酶的活力均衡，能满足郫县豆瓣多种酶协调作用。

图3 制曲过程酸性蛋白酶活性变化Fig.3 Changes of acidic protease activity during Qu making process

图4 制曲过程淀粉酶活性变化Fig.4 Changes of amylase activity during Qu making process

5.3 酶活与发酵郫县豆瓣氨基酸态氮、还原糖的关系

为研究实验菌株各酶活性与发酵郫县豆瓣指标氨态氮和还原糖的影响关系，采用保温发酵工艺制备单菌株、复合菌株发酵郫县豆瓣实验，在前期对单菌株制曲酶活性变化研究基上，采用制曲时间为60h，豆瓣保温发酵时间25d。制曲酶活及发酵样品中氨基酸态氮和还原糖含量见附表。

附表 制曲酶活及发酵样品中氨基酸态氮和还原糖含量Attached table Enzyme activity of Qu and content of ammonia nitrogen and reducing sugar in fermentation samples

从附表可以看出，筛选出的高酶活菌株其豆瓣酱中氨基酸态氮和还原糖含量均高于市售曲精，而混合菌株又明显高于单菌株且氨基酸态氮含量达到1.2mg/100g、还原糖含量达到5.4%，且产品酱香浓郁，色泽红亮。

6 结论

混合制曲的目的即在中性蛋白酶活力保持在要求的基础上，旨在提高成曲中酸性蛋白酶和淀粉酶的活力，为后期发酵提供更充足、更高活力的酶系。

将菌株ddQ-125、jcQ-93和市售曲精单独制曲以及菌株ddQ-125和jcQ-93混合接种发酵制曲的豆瓣曲进行保温发酵25d，对豆瓣曲酶活及豆瓣酱氨基酸态氮和还原糖含量分析，其中菌株单独制曲及混合制曲发酵的豆瓣酱其氨基酸态氮含量均高于市售曲精，且混合菌制曲的指标高于单独制曲，其中氨基酸态氮含量达到1.2mg/100g、还原糖含量达到5.4%；菌株A酸性蛋白酶最高达1650U/g，菌株B中性蛋白酶活力最高达3200U/g，淀粉酶活力最高达300U/g，其中菌株B的总酶活为4300U/g，复合菌制曲其总酶活力高达4550U/g，且3种酶的活力均衡，可见复合菌制曲提高了豆瓣曲综合酶活力，克服了单菌种制曲酶系不均衡的问题，能为豆瓣发酵提供充足的酶系，有效提高氨基酸态氮和还原糖含量，为缩短发酵时间奠定物质基础，为郫县豆瓣规范化生产和规模化生产提供技术保障。

通过实验，郫县豆瓣产品在保持传统郫县豆瓣特色的前提下，缩短生产周期1/3（传统工艺发酵期为50d～60d），氨基氮含量达0.8g/100g～1.2g/100g，豆瓣酱的酱酯香味明显增加。对筛选出的菌株培养的豆瓣曲及发酵产品进行黄曲霉毒素的检测，其黄曲霉毒素B1小于2ppb，低于国家标准5ppb，可以进一步进行生产实验。

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