视黄醇结合蛋白临床应用进展

邓荣春综述，施桥发审校

(1、江西省人民医院检验科，江西 南昌 330006；2、南昌大学医学院免疫教研室，江西 南昌 330006)

视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，RBP)是体内一类将视黄醇(VitA)从肝中转运至靶组织以及实现视黄醇的细胞内转运代谢的特异的运载蛋白，在协助视黄醇储存、代谢及发挥生理功能中起着重要的作用[1]。1968年Kanai等首次分离发现RBP，1971年 Peterson和 Berggard从尿中将其分离，随后在人、小鼠、大鼠、蝾螈、狒狒及猪、牛、绵羊等中对其进行了广泛研究。现在，血清RBP和尿液RBP水平常用作肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察的敏感指标之一，也经常作为临床营养状况评价的指标，用来特异地诊断早期营养不良[2]。本文主要对RBP的理化特性、临床检测方法及临床应用等方面进行综述。

1 视黄醇结合蛋白的理化特性和生理功能

1.1 RBP的理化特性 RBP分子是一条由183个氨基酸残基及少部分糖类组成的多肽链，分子量为21000，沉降系数为 3S，等电点pH 4.4-4.8，半衰期为3～12h。人体内RBP有三种形式，即RBP、RBP1和RBP2，RBP的多肽链失去C末端的亮氨酸残基 (C末端-Asn-Leu)，成为182个氨基酸残基，则为RBP1；失去C末端的亮氨酸-亮氨酸残基(C-末端-Asn)，成为181个氨基酸残基，则生成RBP2。正常人体内主要是RBP、RBP1两种形式，而慢性肾功能衰竭病人体内以RBP2较多[3]。

1.2 RBP的生理功能 RBP的mRNA存在于肝、肾、肺、脾、脑、心和骨骼肌等许多组织中，以肝中含量最高，广泛分布于人体血浆、脑脊液、尿液及其他体液中。它的主要功能是将视黄醇从肝脏转运到上皮细胞供组织利用。RBP在肝细胞中合成后，与视黄醇以1:1(mol)比例结合释放入血，在血液中，又与前白蛋白(prealbumin，PA)以 1:1(mol)比例形成复合物，从而防止低分子量的RBP被肾小球滤过[4]。在血液中RBP以复合物的形式转运体内90%的视黄醇至机体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP能自由滤过肾小球，其中绝大部分(99.97%)被近端肾小管上皮细胞重吸收并被分解，供组织利用，仅有少量从尿中排出[5]。尿中RBP的排出量取决于肾小管的重吸收功能，当肾小球滤过膜或肾小管功能受损时，尿中RBP可明显升高。RBP本身具有很好的稳定性，在体内的含量相对恒定。肝外组织 (如肾脏等)发现大量的RBP-mRNA，提示肝外组织也可合成RBP。肝外组织合成RBP，可能涉及视黄醇的再利用[3]。

2 视黄醇结合蛋白检测方法

测定血/尿中RBP的方法较多，常用的有放射免疫法、免疫电泳、酶联免疫吸附和免疫透射比浊法等[6]，其中灵敏度高、实用性强的为放射免疫分析法(RIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)，而现在临床多采用免疫透射比浊法。

2.1 放射免疫分析法 (RIA)放射免疫分析法是以放射性核素标记的抗原与反应体系中未标记的抗原竞争特异性抗体为基本原理来测定待检样品中抗原的一种分析方法。1985年，Beetham[7]首先建立了放射免疫法检测RBP，血清样品需稀释1/500～1/3600，其线性工作范围为10～200mg/L。此后，范列英[8]等改进125I标记方法，以氯胺-T法进行碘化标记，Sephadex G-75去除游离碘，收集125I-RBP，提高测试效率，该法放化纯度95.4%，标记率81.4%。灵敏度、准确度均良好。批内CV为4.64%(n=20)，批间CV为5.74%(n=8)，平均回收率为98.62%，检测范围为0～320mg/L。血、尿样品均不需稀释即可直接测定。放射免疫分析法测定RBP的灵敏度高，特异性强，精密度好，但由于需用特殊的γ射线计数仪，有放射污染和危害，常用核素的半衰期短，不易快速、灵活的自动化分析等诸多不足，近年来逐渐被其他优秀的标记免疫分析方法所取代。

2.2 免疫电泳(IEP)免疫电泳技术，是区带电泳与免疫双向扩散相结合的一种免疫化学分析技术。其中非浓缩尿蛋白十二烷基硫酸钠-琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)是近几年来发展起来的比较好的尿蛋白电泳方式，分辨率高，蛋白检出限为15mg/L，能检测尿蛋白中所含蛋白成分[9]。主要原理是SDS与尿蛋白结合成一个带负电荷的蛋白质-SDS分子团，以消除尿中各蛋白质分子本身存在的电荷差异，且作为电泳载体的琼脂糖凝胶具有分子筛的作用，电泳时尿中各种蛋白成份在电场中迁移受琼脂糖凝胶的分子筛作用，按分子量的大小进行分离，形成不同条带。常见尿蛋白分子量从小到大排列依次为β2-微球蛋白(分子量12KD)、溶菌酶(分子量14KD)、视黄醇结合蛋白(分子量21KD)、游离轻链 (分子量 25KD)、αl-微球蛋白 (分子量30KD)、白蛋白(分子量 67KD)、转铁蛋白(分子量77KD)、免疫球蛋白(分子量 150～850KD)[9，10]，SDSPAGE电泳膜片经光密度扫描仪可获得尿蛋白图谱，计算后可得出各种蛋白的相对百分含量。该法的优点是操作相对简便，结果清晰，尿液不需要浓缩，尿蛋白的检测下限为15mg/L，缺点是操作时间长，不易进行全自动分析。

2.3 酶联免疫法 (ELISA)酶联免疫法基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面，测定时，将受检样品(含待测抗原或抗体)和酶标抗体或抗原按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物，反应终止时固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例，经洗涤去除反应液中其他物质，加入反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中被测物质的量。该法的优点是操作简单，重复性好及灵敏度较高，所用试剂易得，仪器设备要求不高，所以实用性较强，但操作时间较长。1984年，Lucertini[11]等建立了ELISA检测RBP。1998年谢鑫友[12]等用聚乙二醇为加速剂建立了RBP的快速酶联免疫测定法，具有反应时间短，操作简便，重复性好及敏感性高等优点，可替代进口同类产品。

2.4 免疫比浊法 免疫透射比浊法(transmission turbidimetry)测定RBP的原理是利用抗原(RBP)和特异性抗体(羊抗人RBP抗血清)相结合，形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，其浊度高低即透光度减少、吸光度增加反映样品中RBP的浓度，可由标准品所做的剂量-反应曲线算出。该试剂盒适用于各种类型的半自动、全自动生化分析仪。王宁[13]对免疫比浊法测定血清视黄醇结合蛋白方法学评价，根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)相关文件，对该方法进行精密度、线性、准确性等评价及临床初步应用。结果显示批内CV%＜4.0%，批间 CV%＜5.0%，抗干扰性强，Hb≤4.0g/L、胆红素小于或等于420μmol/L、三酰甘油小于或等于10mmol/L对测定无影响；与进口试剂对比，Y=1.007 5X+0.0029，γ=0.9995，两者相关性良好，试剂开瓶稳定性良好。免疫比浊法测定血清视黄醇结合蛋白，方法简便、快速、灵敏，结果准确，可用自动分析仪测试，适合临床检验科应用。

这些测定方法中，放射免疫分析法灵敏度高，特异性强，但存在环保和操作人员自身防护等问题；免疫电泳法操作费时，不能自动化分析；ELISA只能定性或半定量，最便捷的是免疫浊度法，经济实惠，可以在全自动生化分析仪上定量测定，是值得推广的一种方法。

3 RBP的临床应用

3.1 RBP与肾脏疾病 RBP是一种低分子量的蛋白质，血中游离的RBP可自由经肾小球滤过，并且绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收，在局部被分解供组织利用，仅有极少量从尿中排出。因此，正常情况下血清中RBP维持在一稳定的范围内(25～70mg/L)，尿中 RBP 的量则甚微(＜0.7mg/L)。

当有肾脏疾病时，由于肾小球滤过率下降，肾小管重吸收障碍，血清和尿液中RBP显著增高。在糖尿病肾病、高血压肾病等引起肾小球滤过率(GFR)或肾血流量降低时，RBP的滤过率也相应减少，致使血液中RBP蓄积而浓度增高。其他慢性肾病患者尿中出现管状蛋白尿亦可引起血液中RBP升高，早期比肌酐、尿素氮更敏感，也不受饮食的干扰影响。因此，血清RBP的测定可作为肾小球滤过功能障碍的早期指标[14]。在重金属中毒、慢性肾盂肾炎、狼疮性肾炎、肿瘤化疗药物等所致早期近端肾小管损伤或在肾移植急性排斥反应早期都可使RBP重吸收障碍，尿液中RBP浓度升高。因此，尿RBP测定是评价近端肾小管的功能障碍的早期标志物[15]。

3.1.1 RBP与糖尿病肾病：糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症，是引起糖尿病患者致残致死的重要原因之一。糖尿病肾病起病隐匿，早期缺乏典型临床表现，尿常规检查常呈阴性。近年来国内外有大量研究报道[16-21]在糖尿病肾病患者早期就可出现肾小球滤过率的下降和肾小管损害，血清和尿液中RBP含量在诊断早期糖尿病肾病是一个较敏感的指标，且随着病程的发展而加重，在反映早期肾损害的指标中优于β2微球蛋白和尿微量白蛋白，可作为早期糖尿病肾病的诊断依据之一。

3.1.2 RBP与高血压肾病：高血压是一种临床常见病，可引起遍及全身的小动脉硬化病变。高血压肾小动脉硬化与慢性肾衰竭有明确的因果关系。高血压肾损害早期是一个隐匿的过程，此阶段已出现肾脏的病理改变，而在临床上出现蛋白尿时，肾脏已有明显的病理改变，若按此条件诊断高血压肾硬化，肾脏的病理改变已不可恢复。牟晓峰[22]等采用免疫速率散射比浊法和免疫透射比浊法，检测了122例高血压病人和110例正常人的尿RBP、尿微量清蛋白(mALB)、尿 β2-微球蛋白(β2-MG)和尿转铁蛋白(TRF)的变化。结果发现高血压病人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期组的 RBP、mALB、β2-MG 和转铁蛋白(TRF)均明显高于对照组，并且随着病程的延长有逐渐增高的趋势。尿RBP与尿mALB、TRF呈显著性正相关，提示高血压早期阶段就存在肾小管功能的损害。尿RBP可作为诊断高血压早期肾损害的敏感指标之一。

3.1.3 尿RBP对汞作业者肾脏损害的意义 李晓莉[23]等通过测定85名汞作业者尿汞、血肌酐(BCr)、尿肌酐(UCr)、血尿素氮(BUN)和尿视黄醇结合蛋白(RBP)的水平，发现汞作业组的尿汞水平非常显著地高于对照组(P﹤0.01)，而血肌酐、尿肌酐、血尿素氮水平与对照组比较无统计学意义。这说明汞作业组尽管有尿汞升高，常规肾功是正常的，但汞作业组的RBP水平非常显著地高于对照组 (P﹤0.01)。研究结果提示：对于汞作业者的肾脏损害，RBP较血肌酐、尿肌酐、血尿素氮等传统指标更为敏感。

3.1.4 RBP与其他肾脏疾病：尿液RBP测定在肾病综合征、急性肾小球肾炎、过敏性紫癜性肾炎、急性肾衰病人肾功能的评估中也有较高的价值[24]。由于肾脏有很强的储备代偿能力，当传统的肾病实验室诊断指标发生变化时，肾损伤程度已经很严重。RBP与其他项目联合检查能为肾脏损伤部位及程度提供更准确的鉴别诊断依据。

3.2 RBP与肝脏疾病 RBP在肝脏内合成，当肝脏受各种因素损害后，RBP的合成功能降低，反映在血液中RBP水平的下降，同时，RBP的半衰期较前白蛋白更短，故更能早期敏感地反映肝脏的合成功能与分解代谢的变化。郑红[25]等对35例急性病毒性肝炎血清RBP水平与血清胆红素、谷草转氨酶及碱性磷酸酶活力作相关分析，发现急性肝炎病人血清RBP均显著低于正常人，与血清胆红素、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活力均显著负相关，提示血清RBP水平能准确、灵敏地反映肝功能变化。同时检测血清RBP和尿RBP水平，可有助于鉴别肝肾综合征与肝硬化[26]。肝硬化病人血清RBP水平降低，而尿RBP正常；肝肾综合征者血清RBP显著降低、尿RBP显著高于正常值。

3.3 RBP与营养状况 RBP半衰期短(3～12h)，生物特异性高，许多临床疾病都能影响RBP微循环量，所以血浆RBP水平经常作为临床营养状况评价的指标，用来特异地诊断早期营养不良[2]。Winkler[27]等分析了正在接受营养疗法的营养性疾病患者血浆蛋白变化，发现血浆RBP的变化早于白蛋白和转铁蛋白，并与氮平衡的相关性高于白蛋白和转铁蛋白，表明血清RBP水平是反映营养性疾病疗效的灵敏、特异性指标。

3.4 RBP灵敏反映VitA缺乏症 VitA的储存、代谢必须依靠RBP的协助，否则体内VitA的吸收、储存、转运等环节将会改变，引起组织中VitA的分布不均，进而引发各种疾病，如夜盲症、结膜干燥症，及影响上皮组织、骨组织的生长、分化与繁殖、胚胎发育等[28]。一旦RBP基因发生突变，引起氨基酸改变，则不但会引起体内RBP含量降至极低，而且诱发体内VitA的含量降低，引起夜盲症等[29]。血清RBP浓度与VitA含量相关系数0.879，当血清中RBP低于正常人一半时，病人出现暗适应能力降低。

3.5 RBP与其他疾病[30]乙醇性肌病多有热能-蛋白质营养不足，体内RBP、PA水平是影响疾病发展的重要因素。甲状腺功能低下的病人，RBP下降。蛛网膜下腔出血病人中，RBP与前白蛋白均显著下降，在第4d达到最低水平，以后逐渐恢复，但其下降程度与出血严重程度无关。精神分裂症、消化系统疾病者，其RBP均低于正常人。当体内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP的生物合成。

综上所述，RBP作为一项灵敏的检测指标已广泛应用于肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察中，对VitA缺乏症、吸收不良综合症等均有较高的诊断意义，值得临床推广应用。

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