HSP70与恶性肿瘤关系的研究进展

游朝勇综述 冯一中审校

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)又称应激蛋白(stress protein，sp)，是生物体细胞在热诱导下合成的一组具有高度保守性的蛋白质[1]。近年来，HSPs被发现与恶性肿瘤的发生、发展、复发及预后关系密切。

1 HSP70的研究进展

1.1 HSP70的发现及演变过程

1962年，Ritossa把25℃培育的果蝇幼虫置于32℃热环境中，30 min后发现果蝇唾液腺染色体上出现膨突(puff)，提示该区域的基因转录增强，推测有新的蛋白质合成，Ritossa称之为热休克反应。1974年，Tusseres用SDS--PAGE电泳放射自显影发现，置于热环境中的果蝇唾液腺、脑及其它组织中，许多正常蛋白质的合成减少，却合成一组特殊的蛋白质，从而证实了温度增高而引起的果蝇染色体产生的“膨突”是由于热休克反应激发了染色体内的基因发生转录，合成了特异的蛋白质，并命名为“热休克蛋白”。进入80年代后，Pelbam于1986年提出了HSP是1种分子伴侣的理论；Nover与Soger分别于1984年和1987年阐明了编码HSP的序列、基因结构及其位点，并且确定了是由于高热影响到该基因中保守的上游调节序列，即热休克元件(heat shock element，HSE)而引起热休克应答，从而编码转录合成HSP，将HSP功能与调控的研究上升到了1个新的高度。

1.2 HSP的分类及HSP70分子结构

现已证明几乎所有的活细胞都可被诱导出热休克蛋白，在多种多样的应激因素中，除了非致死性热休克外，还包括一些应激原如环境低温、缺氧、重金属中毒、氧化应激、感染、饥饿、创伤、代谢毒物、氧化反应、化学物质(如乙醛、亚砷酸钠等)、放射线、某些线粒体呼吸链抑制剂、癫痫以及某些药物(如钾离子通道激动剂，腺苷受体激动剂等)。在应激条件诱导下，HSP基因高效表达的热休克蛋白，是广泛存在于生物界中高度保守的一组蛋白质[2]。HSPs在体内可与多种蛋白形成复合体，陪伴蛋白分子在细胞内转运、跨膜，参与蛋白质的折叠与伸展、多聚复合体的组装，发挥其调节靶蛋白的作用，但又不改变靶蛋白的结构[3]，故热休克蛋白又被称作“分子伴侣[4]”(molecularchaperone)。HSPs分为6个家系，分别是：HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素。在众多的热休克蛋白中分子量为70 kD左右的HSP70家族，是被研究的较为深入的1种。按照其表达情况将HSP70分为构成型和诱导型，而构成型HSP70又可分为2种，分别位于内质网和线粒体内。HSP70家族分成：① HSP73(组成型HSP70)，分布于胞核与胞质；② HSP72(诱导型HSP70)，分布于胞核与胞质；③ GRP78，分布于内质网腔内；④ GRP75，分布于线粒体中。其中HSP73和HSP72的同源性达95%，HSP73，GRP75，GRF78存在于非应激的正常细胞中，正常细胞中即可表达，而HSP72仅出现在应激细胞中。各种生物的HSP70及其编码基因均具有进化上的高度保守性，原核生物和真核生物的HSP70有40%～60%的同源性，而不同来源的真核生物其同源性为60%～78%。人类的HSP70相关基因定位于第6号染色体短臂、第14号和第21号等多条染色体上。

HSP70蛋白分为3个结构域：氨基端(1-383)的ATP结合域(ATPbindingdomain，ATP-BD)，有ATP酶活性，可使ATP水解，较C端具有更高的保守性；中心区(384-542)的肽结合部位(peptide binding domain，PBD)，可结合新生肽段，受损的蛋白质；羧基端(543-646)高度保守的末端顺序，可影响HSP70 mRNA 翻译的数量。

1.3 HSP70生物学功能

HSP70主要的生物学功能是在应激状态下保护细胞生命活动必需的蛋白质以维持细胞的生存，主要表现在以下几个方面：①结合其他蛋白质，介导其他蛋白质的折叠和装配；②蛋白质的定位和转运；③参与蛋白质的水解，防止蛋白质聚集；④参与细胞骨架和核骨架之中，活化其他细胞基因；⑤与癌基因或抑癌基因蛋白作用，参与肿瘤的发生、增殖分化及抗肿瘤免疫。HSP70的作用具有以下特点：①HSP70正常状态下水平较低，而应激状态下表达显著提高；②平时HSP70主要存在于胞质中，应激时HSP70迅速进入胞核；③多种因素可诱导HSP70大量产生，具有应激反应普遍性，其诱导合成在转录和翻译2个水平上调节；④HSP70能提高细胞抗应激能力，如HSP70生成量与细胞的热耐受能力呈正相关。

2 HSP70与恶性肿瘤的关系

2.1 HSP70与肿瘤细胞增殖

作为热休克蛋白家族中的重要成员，HSP70能促进肿瘤细胞的生长。HSP70在多种肿瘤组织中表达异常[5]，与肿瘤的发生，发展，肿瘤免疫，肿瘤治疗中耐药性和肿瘤的预后等都有密切关系。HSP70与肿瘤的关系已经引起广泛的重视。肿瘤是机体在内，外因素相互作用下发生的与机体生长不协调的异常增殖群，具有无限增殖的特点，其自身增长需要大量HSP70来调节。正常细胞仅表达少量HSP70，HSP70参与细胞的生长代谢，并受细胞周期的严格调控；而肿瘤细胞即使在无应激条件下，也能独立于细胞周期持续高表达诱导型HSP70，并出现异常分布和定位。如卵巢癌细胞中HSP70的表达较正常卵巢细胞高几倍[6]，免疫组织化学的口腔鳞癌表达更高。2002年，Beer等显示HSP70在早期肺腺癌中过表达是1个不良预后的分子标志物[7]。2003年，Kanazawa等认为：大肠癌组织对HSP70和HSP40表现出特殊的免疫反应性，分别为84%和14%[8]。卵巢癌细胞中HSP70的表达较正常卵巢细胞高几倍[9]。HSP70也可能是早期肝细胞性肝癌的敏感指标[10]。 Nylandsted等[11]首次发现了HSP70的损耗将导致乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤和肝癌等细胞系的死亡，并且HSP70的表达是人类癌细胞存活的先决条件。赵霞等[12]研究HSP70反义寡聚核苷酸阻断Molt-4等肿瘤细胞的内源性HSP70表达，发现HSP70反义寡聚核苷酸的使用可以诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，说明HSP70的表达有助于肿瘤细胞的生存和增殖。

2.2 HSP70与肿瘤细胞凋亡

HSP70还参与了肿瘤细胞的凋亡，主要认为HSP70是通过线粒体途径和受体途径来介导肿瘤细胞凋亡的。HSP70参与细胞凋亡的机制：①已知抑癌基因p53可促进凋亡的发生，当染色体17 p等位基因缺失时可产生突变型p53蛋白，这种蛋白可抑制野生型p53蛋白而阻止凋亡的发生[13]，HSP70可通过阻止突变型p53蛋白的降解来阻止细胞的凋亡[14]；②应激活化激酶JNK(C-JNK N-terminal k=inase)可以活化转录因子AP-1来调节细胞的增殖、炎症和凋亡，HSP70可以通过抑制JNK的去磷酸化来介导凋亡；③由于细胞色素C从线粒体中释放出来后可与凋亡蛋白激酶活化因子1连接，在ATP/dATP依赖状态下活化Caspase-9。活化的Caspase具有活化自生酶原和Caspase-3的能力，故可放大Caspase的级联反应，而且Caspase-9和Apaf-1的连接是Caspase级联活化的关键，且两者是通过的Caspase恢复结构域CAPD连接在一起的。HSP70可通过与Caspase-9竞争Apaf-1的CARD结构序列而导致Caspase-9的失活，从而影响细胞质内Caspase的级联反应，抑制凋亡。HSP70对热、电离辐射、氧化应激等引起的凋亡具有保护作用。温和热处理和转染HSP70基因诱导的HSP70表达与细胞对有毒物质诱导的细胞凋亡的抗性相关，HSP70的高表达可以对热诱导的细胞凋亡起到抑制作用。Inchi等研究表明联合使用非白血性白细胞病细胞衍生的HSP70与树突状细胞可通过诱导特异性细胞毒CD8+T细胞，从而安全有效地消除微量残留白血病[15]。同时HSP70还可通过细胞凋亡机制促进肿瘤细胞的减灭，Aghdassi等用槲皮素去除HSP70在细胞凋亡中具有重要作用，选择性去除HSP70可以用来诱导胰腺癌细胞的凋亡[16]。

2.3 HSP70与肿瘤免疫

在肿瘤细胞表面的HSP70可以引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫，并与DC(树突状细胞)抗肿瘤作用有关[17]。肿瘤细胞自身呈递抗原效率非常低下，原因在于肿瘤细胞MHC Ⅰ类分子往往低表达以及共同刺激分子缺乏。因此，具有肿瘤特异性的CD4+和CD8+淋巴细胞的激活必须依赖于抗原呈递细胞的帮助，在由抗原呈递细胞将内源性抗原和外源性抗原，经MHCⅠ类分子途径和MHCⅡ类分子途径，分别将抗原信息呈递给CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞，通过自然杀伤(natural killer，NK)细胞发挥作用，同时激活辅助性T淋巴细胞释放细胞因子，再经细胞免疫途径发挥抗肿瘤的作用。

肿瘤的免疫主要是由T淋巴细胞介导的，而HSP70又与T淋巴细胞的增殖密切相关，可以促进它的增殖[18]。众所周知，抗肿瘤的肽合成物经由MHCⅠ类分子途径与外源性抗原杂交可以诱导CD8+T淋巴细胞免疫，但是他们激活CD4+T淋巴细胞的作用机制并不是很清楚。直到近来的一些研究表明，HSP70能够通过MHCⅡ类分子呈递途径，增强机体的特异性CD4+T细胞反应[19]，而带有HSP70复合物形成的抗原肽，在引发特定性抗原扩增的过程中是完全必要的。由此可以看出，HSP70不但可以增强特异性抗原CD4+T细胞的繁殖，而且还可以增强肽合成物在人类CD4+T细胞中的免疫原性。与普通细胞相比，肿瘤细胞内含有选择性的膜HSP70。这种肿瘤选择性膜HSP70的表达已经证实了与人类NK细胞介导的溶解的敏感性增强有关。单核细胞通过CD14依赖的信号通路分泌促炎症反应的细胞因子来适应可溶性的HSP70蛋白，并且结合在细胞膜表面的HSP70作为1种由NK细胞介导的细胞溶解攻击靶组织而被识别[20]。大量的实验证明，HSP70的高表达有保护肿瘤细胞的作用，但也有实验表明，在用带有差异性膜HSP70表达模式的自体肿瘤亚系细胞中，HSP70高表达的恶性肿瘤细胞比HSP70低表达的恶性肿瘤细胞更容易被NK细胞杀死。Gough MJ等[21]研究，经过细胞凋亡作用的巨噬细胞可以使HSP70显著地抑制IL-10的分泌和细胞碎片的吞噬作用。而单独的巨噬细胞不能使HSP70产生免疫性刺激。可是，当巨噬细胞在具有细胞杀伤能力的时候，HSP70就明显扮演了激活巨噬细胞信号的关键分子。DC(树状突细胞)其表面存在HSP70 高亲和力的CD91受体，而肿瘤细胞的抗原肽与HSP70结合可诱导DC成熟；而成熟的DC刺激未致敏的T细胞的能力增强，从而能够诱发机体T淋巴细胞的抗肿瘤免疫效应，有效地杀伤肿瘤细胞[22，23]。而DC作为1种专职呈递细胞，其呈递能力最为强大，它能够有效摄取、加工肿瘤抗原，再经MHCⅠ类分子、MHCⅡ类分子途径呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞，使之激活，产生特异性的抗肿瘤免疫应答。

2.4 HSP70与肿瘤的治疗

肿瘤的治疗有多种，目前主要有2种治疗研究较多，一种是肿瘤的免疫治疗，尽管现在可以针对许多种肿瘤产生针对性的抗肿瘤免疫，但大多数的肿瘤细胞在肿瘤表达的过程中会产生耐受的现象。这些耐受的现象包括很多机制，像肿瘤细胞T淋巴细胞的杀伤力的减弱，MHCⅠ类分子的调节低下、免疫监视的逃脱和肿瘤抗原耐受性的增强等。Calderwood等[24]，认为细胞外的HSP70是肿瘤免疫治疗的有效试剂，它能够阻断肿瘤相关抗原耐受过程，并且通过细胞毒素CD8+T淋巴细胞杀伤特定的肿瘤细胞。FU等[25]将HSP70与白细胞介素2(IL-2)以不同的计量和时间间隔分别注入已移植出肿瘤的老鼠体内，实验结果表明HSP70比IL-2能更有效的抑制肿瘤的生长或者在不同程度上延长老鼠的寿命，而在两者复合治疗过程中HSP70在延长和消除肿瘤的作用中也起到了主要的作用。另一种是肿瘤的基因治疗。基因治疗的目的是诱导转基因表达的紧密间隙和时序控制，关于可诱导的基因启动子在用于自杀基因的调控上有很多种途径。Schmidt等[26]，在体外分别用头、颈部2种稳定的细胞株进行试验，将2种启动子分别作用于2种细胞株并且用荧光激活细胞分类技术、蛋白印迹分析技术和荧光显微镜检查技术分析测量这2种因子对基因活化的作用。结果表明HSP70启动子在2种细胞株中的1种，其基因活性是已报道基因表达活性的5.83倍。因此，HSP70启动子为基因治疗提供了1种有用的途径。同时，热诱导的HSP70启动子用于基因治疗的这个特性在体内和体外等许多的肿瘤株中也得到了证实[27]。另外国内也有文献报道在胃癌、宫颈癌细胞中HSP70 mRNA大大增强的结果。为应对这种变化，细胞就需要合成足够量的HSP70。因此，其调控机制就促进HSP70基因大量合成mRNA，从而使HSP70呈现高表达。而高表达HSP70可以抑制肿瘤细胞死亡，使肿瘤细胞产生耐受，如果通过抑制mRNA的转录可以减少HSP70表达,就可以有效地杀伤肿瘤细胞，从而就可以为肿瘤的基因治疗提供1个新的途径。

总之，HSP70作为分子伴侣的1种，在多种恶性肿瘤中呈现高表达，与大部分恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡及预后关系密切，在恶性肿瘤的发生发展过程中有重要作用。明确HSP70的调控机制及作用过程，将有利于肿瘤发病机制的阐明，并为肿瘤的诊治提供更充分的理论依据。随着生物技术的发展，HSP70将作为治疗肿瘤的靶点，并以此为肿瘤治疗设计新的抗癌药物。HSP70反义RNA可阻断肿瘤细胞HSP70的表达，阻止肿瘤细胞中蛋白的合成，抑制肿瘤细胞增生。肿瘤细胞中可提取可溶性HSP(主要是HSP90，HSP70及gp96)，制成HSP-PC疫苗，用于治疗肿瘤，这些都为肿瘤的治疗提供了1个新的思路，是我们研究的方向。

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