二甲基苯蒽诱发大鼠乳腺癌的病理及淋巴管生成的研究

邹利光 张 松 戚跃勇 廖翠薇 梁开运

乳腺癌是威胁妇女健康最常见的恶性肿瘤，乳腺内淋巴管十分丰富，淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径，是决定乳腺癌分期和治疗方案选择的关键因素之一[1]。随着淋巴管内皮细胞相关因子研究的进展，探讨淋巴管生成与乳腺癌转移扩散的关系成为乳腺癌研究新的热点[2，3]。本文采用二甲基苯蒽灌胃诱发大鼠乳腺肿瘤，动态观察乳腺癌发生过程中乳腺组织形态学改变和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)变化，分析乳腺癌病理分级与肿瘤LVD的相关性。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立

38～50天龄SPF级Wistar雌性大鼠96只，体重105～142 g，由第三军医大学实验动物中心提供。7,12-二甲基苯蒽(7，12- demethylbenz[a] anthracene，DMBA)(美国Sigma公司)，兔抗鼠 podoplanin抗体(AngioBio公司)。配制浓度为10 mg/ml的DMBA麻油溶液，将96只大鼠分批进行灌胃，一次剂量为1 ml，1周后，应用同样的剂量进行第2次灌胃。

1.2 病理观察

造模后每日观察大鼠大体情况，手摸6对乳腺部位，记录有无特殊改变。从第1次灌胃日计时，排除9周前早期死亡的16只大鼠，存活≥10周大鼠80只。从第10周开始，每2周取10只大鼠活杀，至第24周处死所有大鼠。取乳腺肿瘤组织置于10%甲醛液中固定，石蜡包埋。HE染色，确定乳腺肿瘤病理类型及分化程度。乳腺肿瘤组织学分类参照WHO乳腺肿瘤组织学分类标准(2003)[4]，大鼠乳腺癌病理诊断参照Dunn等提出的实验性大鼠乳腺癌的诊断标准[5]。参照微血管密度计数法，采用“热点”法计数淋巴管密度，低倍视野(×100)下寻找热点，高倍视野(×200)下计数3个视野最高数目的微淋巴管，以其平均数表示。分别计数肿瘤中央和周边部位的LVD。取乳腺肿块组织抗podoplanin抗体免疫组化和免疫荧光染色，观察抗podoplanin抗体与淋巴管特异性结合情况。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行数据分析，均数差异采用单因素方差分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺肿瘤诱发结果

16只大鼠于9周内死亡，80只大鼠存活≥10周。第8周开始大鼠乳腺内出现小结节，大小0.3～0.5 cm，为乳腺普通增生或非典型增生，随观察时间延长，乳腺肿块增多增大，第12周发展为乳腺癌，到后期乳腺肿块以乳腺癌为主。80只大鼠中，75只成功诱发乳腺肿块，其中乳腺良性增生16只，炎性肉芽肿2只，乳腺癌57只，乳腺癌诱发成功率为71.25%。57只乳腺癌大鼠共有72个乳腺肿块，其中43个肿块分布于第一对乳腺，15个肿块分布于第二对乳腺，第三、四对乳腺各4个肿块，第五、六对乳腺各3个肿块。诱发肿瘤最小直径为0.4 cm×0.5 cm，最大直径为3.1 cm×3.5 cm。同一大鼠乳腺肿瘤数：1个肿瘤42只，2个肿瘤9只，3个肿瘤4只。所有乳腺肿瘤均为实性肿块，良性增生肿块形态较规整，边界清楚；恶性肿瘤形态不规整，可见分叶，8个乳腺癌中央有坏死区。

2.2 病理形态学观察

第10周见有类似于人乳腺导管上皮细胞普通增生和非典型增生，随观察时间延长，乳腺上皮细胞非典型增生更加明显，第12周见有乳腺癌形成。16只乳腺良性增生大鼠中，非典型增生11只，旺炽性增生2只，腺病3只。乳腺癌表现为细胞核大、异型、深染、排列紊乱。57只乳腺癌大鼠中，浸润性导管癌34只，浸润性小叶癌9只，乳头状腺癌6只，其他类型肿瘤8只。不同部位肿瘤分化程度有明显差异，高分化6只，中分化30只，低分化21只。

2.3 肿瘤淋巴管密度

Podoplanin免疫组化染色阳性定位于淋巴管内皮细胞的胞膜及胞质内，可见微淋巴管被染成棕黄色，阳性淋巴管多为单层内皮形成，管壁薄，多呈扩张型，管腔大，形状不规则，或者呈闭锁条索状，有的淋巴管存在管壁的开放，且可观察到癌栓从淋巴管开放处进入淋巴管内的现象，管内偶见淋巴细胞，也可见几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞。非典型增生可见个别新生淋巴管和少量较大、较成熟淋巴管，旺炽性增生与腺病未见新生淋巴管，16只乳腺增生性疾病大鼠LVD平均值为(1.52±0.23)个/高倍视野。乳腺癌棕黄色微淋巴管“热点”区，多位于肿瘤边缘部位和癌巢周围的间质中，边缘区LVD明显高于中央区。乳腺癌LVD随肿瘤分化程度的降低而升高，高分化、中分化和低分化乳腺癌LVD分别为(4.43±0.68)、(5.83±1.03)和(9.48±0.93)个/高倍视野，平均值为(6.93±0.84)个/高倍视野。乳腺癌LVD显著高于乳腺增生性疾病(F=14.03，P<0.01)，低分化乳腺癌LVD显著高于中、高分化乳腺癌(F=38.25，P<0.001)。不同组织学类型乳腺癌LVD差异无统计学意义(F=3.35，P>0.05)。

3 讨论

大鼠乳腺癌模型的建立有诱发性、种植性和自发性3种类型，以DMBA诱导大鼠乳腺癌属于诱发性模型，是较为成熟的乳腺癌动物模型，广泛用于肿瘤的病理形态学、分子生物学、影像诊断和药物治疗研究[6,7]。淋巴管在恶性肿瘤的生物学中扮演着重要的角色，肿瘤生长最初是通过简单的扩散方式获得所需营养的，淋巴管呈网状参与血流氧气和淋巴成分的扩散，维持肿瘤生长。相对于血管而言，淋巴管不仅营养原发肿瘤，而且也有利于转移瘤的生长和再转移[4～7]。淋巴管的管腔比较粗，管壁较薄、流速缓慢，与组织液的组成基本相同，因此更有利于肿瘤细胞的存活和转移扩散。另外，淋巴管参与肿瘤新生血管的形成，也会间接促进肿瘤生长。研究表明，肿瘤周边与肿瘤内部淋巴管的功能存在显著差异，肿瘤内部淋巴管因挤压而呈条索状甚或闭塞状，淋巴管功能较低；而肿瘤周围及瘤旁的淋巴管则呈扩张状态，淋巴管内皮细胞间的连接由复杂型向简单型过渡，大量连接开放形成宽的内皮细胞间隙通道[8]。肿瘤周边部分淋巴管密度较大，淋巴管功能较明显。目前认为，无论肿瘤内部还是肿瘤周围淋巴管，均与肿瘤淋巴转移密切相关[9,10]。

人们已经发现很多淋巴管标记物可用于识别淋巴管，目前认为比较好、应用最多的淋巴管标记物主要有下列3种：VEGFR-3、淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)以及podoplanin。VEGFR-3也称FLT4，属于受体型酪氨酸蛋白激酶家族成员，是最早发现的淋巴管内皮特异性分子标记物，曾经认为VEGFR-3是1个淋巴管内皮特异性标志物，最近研究发现，它在正常组织的某些小血管和一些病理状态下新生的血管中有表达，在血管母细胞瘤、成胶质细胞瘤等一些缺乏淋巴管的肿瘤中也有表达[8,9]。LYVE-1与透明质酸在淋巴管腔表面共同表达，过去曾认为LYVE-1是特异性最强的淋巴管内皮特异性标志物，但近来研究发现，在肝脏和脾脏的血窦内皮细胞及胎盘合胞体滋养层细胞中都有表达[10]。Podoplanin是1种细胞膜黏蛋白，最早发现于肾小球足突细胞，为淋巴管生成所必须，且能促进内皮细胞黏附、移行和淋巴管生成，podoplanin主要表达于淋巴管内皮细胞，在淋巴管瘤和具有淋巴分化的血管肉瘤中也有表达[11]，主要是表达于小的淋巴管，而在血管内皮中不表达。上述3种淋巴管标记物中，podoplanin在淋巴管内皮细胞中表达特异性强，且只表达于淋巴管内皮细胞，适用于区别淋巴管和血管。

LVD即单位面积中毛细淋巴管及淋巴管的数目，LVD计数成为目前公认的量化评价肿瘤血管生成活跃状况的指标，它可以反映肿瘤血管生成情况，并与肿瘤的恶性程度密切相关，评价LVD对区分肿瘤良恶性和分级、判断肿瘤预后有重要的价值[2,8]。我们研究发现，随着乳腺肿瘤组织分化程度的降低，LVD逐渐升高，乳腺癌LVD显著高于乳腺增生性疾病。不同组织学类型乳腺癌间LVD差异无统计学意义，不同分化程度肿瘤间其差异有统计学意义，低分化乳腺癌LVD显著高于高分化和中分化乳腺癌。乳腺癌不同部位分化程度可存在显著差异，podoplanin免疫组化染色“热点”区多位于肿瘤边缘部分，肿瘤周边部分生长活跃，肿瘤淋巴管生成明显，LVD较中央部高。

总之，DMBA灌胃诱发大鼠乳腺癌是较为成熟的乳腺癌动物模型，Wistar雌性大鼠对药物耐受性较好，乳腺肿瘤诱发成功率较高。乳腺癌淋巴管丰富，肿瘤淋巴管生成是其生长、浸润和转移的基础，随着肿瘤恶性程度的增高，在大量促淋巴管生成因子的作用下，出现了大量肿瘤新生淋巴管，肿瘤新生淋巴管导致LVD增高，LVD与肿瘤病理分级存在明显的相关性。

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