白色念珠菌检测方法的研究进展

欧阳珂珮，刘生峰，肖进文，李应国，李洪军，贺稚非

(1.西南大学食品科学院，重庆400715; 2.重庆出入境检验检疫局，重庆400020; 3.重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆400020 4.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400715)

白色念珠菌检测方法的研究进展

欧阳珂珮1，2，3，4，刘生峰2，3，肖进文2，3，李应国2，3，李洪军1，4，*，贺稚非1，4

(1.西南大学食品科学院，重庆400715; 2.重庆出入境检验检疫局，重庆400020; 3.重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆400020 4.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆400715)

白色念珠菌是导致真菌感染的重要致病菌之一，文章对白色念珠菌的生物学特性和检测方法进行了综述。目前我国尚未出台食品中白色念珠菌检测的相关标准。本文通过对白色念珠菌检测技术发展历程的梳理，旨在为广大科研工作者、行业法规制定者提供一些参考依据。

白色念珠菌，特性，检测方法

1 白色念珠菌的生物学特性

1.1 一般特性

白色念珠菌(Candida Albicans)又称白假丝酵母菌，广泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病性。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白色念珠菌就会繁殖并改变生长形式侵入人体细胞从而引起疾病。

白色念珠菌细胞呈卵圆形，致病性菌株细胞呈现假菌丝。该菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，以37℃或室温孵育2～3d后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。若接种于4%玉蜀黍琼脂上，室温孵育3～5d可见假菌丝，芽生孢子，厚膜孢子。白色念珠菌对热的抵抗力不强，加热至60℃，1h后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。

1.2 白色念珠菌的致病性研究

1.2.1 致典型症状及易感人群 白色念珠菌引起浅表性感染和深部感染，该种菌引起的相关疾病有皮肤念珠菌病，包括指(趾)间糜烂，多见于长期从事潮湿作业的人、念珠菌性间擦疹多见于小儿和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多见于肥胖儿童、念珠菌性甲沟炎、甲床炎多见于指甲;粘膜念珠菌病，包括多见于婴幼儿患者的鹅口疮，以及生殖器念珠菌病;而深部感染疾病则包括内脏念珠菌病，该感染可累及全身所有内脏器官，其中以肠念珠菌病及肺念珠菌病较常见。此外，可引起泌尿道炎、肾孟肾炎、心内膜炎及脑膜炎等，偶见其引发念珠菌性败血症。念珠菌疹，即念珠菌及其代谢产物引起的皮肤变态反应，主要损害为成群的无菌性水疱，多见于手指间;也可见到银屑病样、玫瑰糠疹样、脂溢性皮炎样、荨麻疹样、离心性环状红斑样损害。

1.2.2 导致念珠菌感染的因素 念珠菌病主要是白色念珠菌引起的急性、亚急性或慢性感染，是最常见的真菌病。临床症状错综复杂，急缓不一，儿童多为急性继发性感染。该病常侵犯皮肤、粘膜，也可引起内脏或全身感染。所有内脏感染常继发于多种慢性消耗性疾病，且有长期应用广谱抗生素、皮质激素及化疗、放疗等诱发因素。近年来随着大剂量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，以及器官移植术的开展，其发病率渐趋增高，并可危及生命造成严重后果。

除了引起浅表性感染的酵母型之外，所谓的假菌丝体是类酵母真菌的另一种形态学表现。芽管和假菌丝体的产生主要发生在侵入性感染的病人体内。此外，念珠菌属酵母菌能够产生和分泌多种酶，使兼性病原体微生物能够穿透血管和粘膜屏障。念珠菌属各种病菌一般是通过污物的污染进行传播的，主要的入口是鼻咽通道，但脂肪酸、酸性pH和敌对性菌群等也会引起皮肤表面抑制真菌感染的功能障碍，从而导致浅表性的念珠菌病。病菌感染粘膜后，侵入性的念珠菌病会从胃肠道向外传播。

2 白色念珠菌的检测方法介绍

白色念珠菌的检测方法主要分为传统培养结合生理生化鉴定以及基于分子生物学所发展的快速检测方法两种。

2.1 以微生物培养为主的传统检测方法

目前国内食品检验机构对白色念珠菌的检测几乎全是利用白色念珠菌的形态特征和生理生化特性，用微生物培养的传统方法对白色念珠菌进行分离鉴定的方法。

对于食品中白色念珠菌的检测，目前主要参照参考文献［1］中所述标准方法进行检测。首先增菌培养，取供试液10mL(相当于供试品 1g、1mL、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100mL)的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48～72h。然后，取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基平板上，培养24～48h(必要时延长至72h)。根据菌落形态初步判定。

白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深，质地变硬或有褶皱。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48h(必要时延长至72h)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80－玉米琼脂培养基上，培养24～48h。取培养物进行染色、镜检及芽管实验。此外，也有相关文献报道了白色念珠菌在各类培养基上的菌落特征，便于用以检验判定该菌存在。

白色念珠菌在1%聚山梨酯80－玉米琼脂培养基上呈灰色或奶油色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。白色念珠菌在血平板上呈灰色或奶油色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。白色念珠菌在TTC(氯化三苯四氮唑－沙氏琼脂培养基)培养基平板上呈乳白色或淡红色，菌落小，其他酵母菌为红色、热带念珠菌为深红色或紫色。通过培养法初步鉴定后，要用白金铒挑取少量的培养物，进行芽管试验进行最终判定。

中国药典(2010版)中对四种推荐使用培养基做了比较，其中除了沙氏葡萄糖液体培养基只具有促生长能力外，沙氏葡萄糖琼脂培养基、1%聚山梨酯80－玉米琼脂培养基、念珠菌显色培养基都具有促生长能力与指示能力。其中念珠菌显色培养基还具有抑制大肠埃希菌的能力。

目前山东出入境检验检疫局等单位正在制定进出口食品白色念珠菌的检测方法行业标准。包括中国药典中对白色念珠菌的检测都是以上述经典培养方法为基础，其准确性、快速性均有提升空间。

而国外关于利用微生物培养法鉴定白色念珠菌的研究在上世纪 90年代有所报道。在 1994年Patricia Rousselle和 Anne－Marie Freydiere［2］采用Albicans ID和Fluoroplate两种商业上可用的固体培养基进行白色念珠菌的快速鉴定。发色体或荧光团被放置在这两种培养基的底层，以便于检测和鉴定白色念珠菌。实验对723个酵母菌株及352个白色念珠菌菌株的1006个临床样本进行了检测。这两种培养基的灵敏度为别为93.8%及98.6%，并且对热带念珠菌有5个假阳性反应，无假阴性反应。

2.2 以分子生物学为基础的快速分析法

自上世纪80年代起，以分子生物学为基础的快速分析法已经开始兴起，近年来在医学界对白色念珠菌的检测已经深入到亚型之间的鉴定，并且有相当快速的检测方法，能够区分死菌活菌、致病型非致病型，从而提高了白色念珠菌的检测精度和检测效率。

上世纪末，关于白色念珠菌的检测方法有湿片法、免疫血清检查、培养观察菌落特征和菌体形态及生化特性检验、动物接种等。湿片法敏感性较低(30%～50%)［3］，由于白色念珠菌可在人体的一些部位正常寄居，其孢子可存在于正常人体［4］并与人体某些组织间有共同抗原［5］，使免疫血清鉴定缺乏特异性。并且由于白色念珠菌存在两种表型:酵母相和菌丝相，前者为芽孢和出芽，为无症状寄居的表型;后者为芽管和菌丝，为致病状态的表型;医学上检测必须同时观察到孢子和菌丝才有诊断意义。动物接种等方法较为可靠，但手续繁琐、耗时长，对早期诊断不利，难以推广。因此上世纪已经有相关分子生物学的先进手段应用于深部白色念珠菌感染病患的检测。

之后，随着分子生物学研究的不断深入，手段的不断提高，新的技术也普遍应用于白色念珠菌的检测中，并且出现了许多能够灵敏快速的区分鉴定出白色念珠菌及念珠菌属其他菌种的方法。

2.2.1 白色念珠菌基因研究为快速分析法的建立提供理论依据 早在2003年人类已经完成了白色念珠菌的全基因测序，这也是迄今为止第一个，也是唯一一个完成测序的致病真菌微生物。有关白色念珠菌的功能基因的相关研究自上世纪末起也在不断的深入。这些相关基因的报道及其作用机制的阐明对白色念珠菌快速检测无疑提供了非常强大的理论保障。白色念珠菌的功能基因包括结构基因，形态相关基因、代谢相关基因、基因信息传递基因、致病基因、耐药基因等［6］。相关基因所控制的生化反应以及表达产物都为分析方法的建立提供了理论依据。

目前研究较多并应用于分析检测方面的热点主要集中在粘附性蛋白相关的基因、致病性基因及结构基因及其表达所涉及蛋白等方面。

早在1996年Spreghini［7］等在研究白色念珠菌表面玻连蛋白(VN)受体时发现，αvβ3或αvβ5整合素的抗体可抑制白色念珠菌黏附于波连蛋白(VN)，从而推测αvβ3和αvβ5整合素作为白色念珠菌表面的VN受体介导黏附。2001年Klotz［8］等发现白色念珠菌表面存在一种醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)并推测其为介导白色念珠菌黏附于FN和VN的酶类。

1999年Kinneberg［9］等认为白色念珠菌INT1基因对其菌丝生长、黏附作用和致病性均有作用。而2002年Wiesner等［10］研究INT1变异的白色念珠菌时更进一步的发现，INT1基因对菌株的黏附性的影响与菌株所处的形态有关，当菌株处于酵母态时，INT1基因促进起黏附作用，但当菌株呈菌丝态时则没有作用。

1999年Stmdstrom［11］认为HWP1作为芽管、菌丝中特有的黏附素，是通过转谷丙酰氨酶(transglutaminase，TGase)机制介导白色念珠菌与颊黏膜上皮黏附的。2002年Sundstrom［12］研究了三种(Hwp1p、Ala1p/Als5p、Als1p)来自白色念珠菌的结构相关性黏附素并阐明了其黏附作用的机制。Fu等［13］发现白色念珠菌可同时调节菌丝生长与细胞间凝集的糖蛋白Als1p，该蛋白基因的表达受转录因子Efg1p控制。Gaur等［14］研究了Ala1/Als5p基因及其粘附特性，得出特定氨基酸对于Ala1/Als5p基因的介导黏附有着识别作用。Zhang等［15］则认为ALS基因家族所编码的蛋白参与介导白色念珠茵与内皮细胞、上皮细胞的黏附。

2.2.2 上世纪白色念珠菌快速分析法的发展轨迹

2.2.2.1 以核酸为目标的快速检测方法 早在1993年，ANN R.HOLMES［16］等人就利用白色念珠菌中rRNA编码区互补的引物进行PCR，以此来检测含有不同念珠菌种的血液样本中菌种的DNA。他们研究并报道了一个只在白色念珠菌的DNA中扩增出来的684bp的片段，白色念珠菌检测的敏感度为(15± 5)CFU/mL血液。同年，YOZO MIYAKAWA等人［17］研究了一种利用PCR来扩增一个种间特异含有125bp碱基的DNA片段。DNA模版中还加入了热带念珠菌和能跟两种细胞都反应的抗体。这种组合将白色念珠菌的检测灵敏度提高到了3CFU/0.1mL。1994年ANN R.HOLMES［16］又报道了基于5S rDNA的PCR扩增和相邻DNA区域的基因(NTS)所设计的灵敏、快速检测白色念珠菌或血液样本中的其他念珠菌的方法。

除了普通PCR技术的应用，分子杂交以及荧光探针也出现在早期白色念珠菌快速分析法的研究中。1996年Axel Lischewski，Rudolf I.Amann［18］设计了一条能与白色念珠菌和热带念珠菌185rRNA相结合的荧光标记的寡核苷酸探针。应用该条探针进行荧光原位杂交能够很容易的将白色念珠菌从其它细胞中区分开来。

随着生物学上对白色念珠菌研究的进一步深入，相关基因的发现，给白色念珠菌在21世纪能够被广泛深入的研究打下了良好基础。

2.2.2.2 以蛋白质等其他大分子为目标的快速检测方法 除了利用基因作为检测对象的分析方法的建立外，也有许多研究者将目光投向了具有免疫特性的功能蛋白与受体上。

1999年Mardh PA等人［19］于2002年报道了直接免疫荧光法检测白色念珠菌，直接免疫荧光技术与间接免疫荧光技术相比，前者背景染色浅、简单易行、用时少、易于区分正常寄居和致病状态。目前这种方法被推广应用于妇女白色念珠菌阴道炎的检测中。

2.3 白色念珠菌快速检测方法的发展趋势

近年来，早期的白色念珠菌快速检测方法不断地优化实验条件、简化实验步骤、降低检测成本。此外，新的检测方法向着速度更快、检测限更低、通量更高、能够同时检测多种微生物的方向发展，荧光定量PCR、RNA印迹杂交等诸多新技术已越来越普遍地应用于白色念珠菌的快速检测中来。

2.3.1 以PCR技术为核心的新型PCR检测方法蓬勃发展 2003年卢雪红、罗萍等［20］应用复合 PCR法，检测老年人未感染的及已感染的腹膜透出液中的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。复合PCR法与传统培养方法相比具有快速、特异、敏感的优点，并发现近年来老年人腹透液中白色念珠菌感染率明显增高。

Mirhendi等［21］报道了一种新的引物，可以同时用于普通PCR和PCR－RFLP方法检测白色念珠菌，当PCR用于检测纯化的DNA时，此方法的精确度大约为1pg真菌DNA。

Kyle T.Beggs，Ann R.Holmes等人［22］设计了针对口腔中白色念珠菌反转录的特异性引物，对白色念珠菌mRNA进行了检测。

Silvia Arancia等人［23］报道了利用CaMP65特异性探针实时荧光定量PCR分析，建立了一种快速检测和量化白念珠菌的生物样品(血、尿和血清)的方法。

Grzegorz Kofla等人［24］在研究中利用实时荧光定量PCR(TaqMan)试验做了简短的报道，对MDR1，CDR1和ERG11的基因表达水平的量化分析。

Huaguo Xiang等人［25］设计了一对通用引物，其靶向从28S rRNA到5.8S rRNA的基因区域ITS2区，用来扩增6种PCR念珠菌属的致病菌包括C.albicans，C.tropicalis，C.krusei，C.glabrata，C. parapsilosis，C.dubliniensis。实验结果该方法检出率和灵敏度远高于培养法和湿片法。

2008年刘有旺等人［26］报道了一种快速检测奶牛酵母菌性乳腺炎的方法，研究人员根据白色念珠菌ITS1－ITS2部分的保守序列设计了一对特异性引物，建立了PCR检测方法。实验表明，方法的特异性为100%，敏感性检测的最低浓度为:1.25×103CFU/mL，该方法具有快速、准确和特异的优点。

2.3.2 结合物理新方法的应用尝试 2009年Rafael Mulero等人［27］提出了一种新的检测方法，它利用恒定电流通过微孔，测量当单独的念珠菌改变位置或通过微管时，外部电流形态的变化，从而计算出其浓度含量。这种方法在白色念珠菌的检测上尚属首次。也成为白色念珠菌快速检测法研究的新视角。

3 结论

国内外食品药品中常检出白色念珠菌，该菌的致病性已引起国内外广泛关注，因此，在食品药品中检测白色念珠菌具有重要的卫生意义。目前食品中容易被白色念珠菌所污染的第一大类产品就是乳制品。由于奶牛酵母菌性乳腺炎大多数是由白色念珠菌引起的，因此感染该病症的牛所产牛乳有可能也带有致病菌。此外药食同源的中药材以及其制品中也易带菌。

国外已对该致病菌做了相关风险分析，如《日本药典》(第15版)对用前需加开水的草药的微生物指标中都规定了(10g样品中)不能检出白色念珠菌的限量要求。但我国目前仍未正式出台相应的国家标准和行业标准，因此迫切需要制定相关标准以便于我国食品药品检验监管，从而保障我国人民食品药品安全，并促进进出口食品、中药材安全卫生标准与国际接轨。目前国家检验检疫局已经开始着手制定相关行业的行业标准，相信在不久的将来，白色念珠菌的检测水平的提高将推动我国食品安全上升到新的高度。

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Research progress on the detection method of Candida albicans

OUYANG Ke－pei1，2，3，4，LIU Sheng－feng2，3，XIAO Jin－wen2，3，LI Ying－guo2，3，LI Hong－jun1，4，*，HE Zhi－fei1，4
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China; 2.Chongqing Entry＆Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020，China; 3.Chongqing Import and Export Food Safety Engineering Technology Research Center，Chongqing 400020，China; 4.Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center，Chongqing 400715，China)

Candida albicans is one of the most important pathogens in fungal infection.The progresses in the recent studies related to the biologic characterizations and the detcction method of Candida albicans was reviewed.At present our country had not yet been introduced food of Candida albicans in testing standards.This article researched of Candida albicans detection technology development history，wanted to provide some references for the majority of researchers and industry law makers.

Candida albicans;characterizations;detection method

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0420－05

近年来，随着人类环境、疾病等方面的改变，真菌类感染的发病率呈现逐年上升的趋势，白色念珠菌是导致真菌感染的重要致病菌之一，此外它还是重要的食源性致病菌。因此，开展白色念珠菌检测方法研究在医学临床检验、食品安全检测领域都具有重要意义。目前，有关白色念珠菌快速检测的相关报道多见于国内外医学领域，在食品检测方面尚属空白，国内外也没有出台相关的行业标准。目前国内所采用的方法和正在制定的标准采用的方法也都是传统方法，这些方法易产生假阳性的情况，且耗时长。采用PCR、荧光定量PCR方法不仅可以快速检测白色念珠菌，还可以准确定量。由于白色念珠菌是一种条件致病菌，其致病性与之存在量效关系，因此定量检测方法的建立对判断食品受污染的程度以及可食用性无疑有着重要的意义。另外，采用RT－PCR的方法可以快速鉴定区分白色念珠菌死菌与活菌，亦可了解食品原料加工中受污染的情况。

2011－12－16 *通讯联系人

欧阳珂珮(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品生物技术。

重庆市科委攻关项目(CSTS2011AC1057);质检公益项目(201010045)。