FOXC1与基底样乳腺癌的研究进展

付 晶 卢康平综述 张清媛审校

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年来，以基因表达谱为基础的乳腺癌基因分型将乳腺癌分为4个亚型[1]，其中基底样乳腺癌因表型独特，侵袭性强，预后差等特点引起广泛关注。基底样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)是以表达基底细胞或肌上皮细胞相关蛋白为特点的乳腺癌，其雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)及人表皮生长因子受体 2 (human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)常表达为阴性。BLBC好发于绝经前的非洲裔美国女性，占乳腺癌总发病率的15%，占三阴性乳腺癌发病率的60%～90%[2]，平均发病年龄为47～55岁，组织学类型以浸润性导管癌和髓样癌为主[3]，组织学分级高，易出现脑、肺转移，且对内分泌治疗及靶向治疗不敏感。在BLBC所表达的标志物中，CK5/6是目前被认为诊断BLBC的指标，被广泛应用[4]，但其表达不具特异性。因BLBC没用统一的诊断标准，不同研究者定义BLBC标准不同，研究结果也不尽相同。所以BLBC的特异性分子标志物的界定成为急需解决的关键问题。在寻找特异性分子标志物的过程中，转录因子FOXC1(Forkhead box C1)因在BLBC中高表达[2]而成为研究BLBC的热点。我们就FOXC1在乳腺癌中的表达、促进乳腺癌的发生、发展机制及其与预后的关系作一综述。

1 FOXC1的分子结构和生物学特点

FOX(Forkhead box)家族是1个庞大的转录因子家族，广泛存在于从酵母到人类的不同种属，其成员分属19个亚家族，即FOXA-FOXS。FOX家族成员具有高度保守的DNA结合区和转录调节区，主要通过转录调节和信号转导途径来调节组织特异性基因表达、胚胎发育、细胞增殖、分化、转移和凋亡等多个生物学过程。转录因子FOXC1是FOX家族的一员，位于人染色体6p25基因编码区，分子量为56789 Da，全长3.5 kb，含有1个长度为1.6 kb的外显子，编码的蛋白质大小为553个氨基酸。FOXC1因含有3个a-螺旋，3个β折叠和2个特征性翼状的大环结构而呈螺旋翼状结构。FOXC1蛋白从N端到C端的结构依次为转录激活区(AD1)，DNA结合叉头区(FHD)，抑制区/磷酸化区和转录激活区(AD2)。叉头区的两端均有1个核定位信号(NLS)，位于C端的NLS为经典基序。FOXC1的功能研究主要集中在胚胎、器官发育及组织特异性基因表达方面。在FOXC1基因敲除的动物模型中观察到，心脏、肾脏、脑膜、骨骼、体节及眼部视前段的发育均出现严重缺陷[5]。同时，FOXC1也是眼睛发育过程中的重要转录因子，其基因突变可导致多种青光眼表型和人类阿克森费尔德·里格尔综合征(ARS)。近期研究表明，FOXC1在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。对妇科肿瘤的研究发现，宫颈癌的组织分化程度越低，侵袭性越强，FOXC1 蛋白表达越低，表明FOXC1蛋白的表达与宫颈癌恶性程度呈负相关[6]。

2 FOXC1与乳腺癌

2.1 FOXC1在乳腺癌分子分型中的表达

Nielsen 等提出的用免疫组化代替基因图谱诊断BLBC的标准为ER、HER2表达阴性，基底细胞角蛋白(CK5/6，CK14，CK17)、EGFR或者 c-kit表达阳性的乳腺癌[7]。Ray等[2]在以基因图谱分类的4种乳腺癌分子分型中分别检测FOXC1、CK5、CK14、EGFR、c-kit及P-cadherin的表达，结果发现，FOXC1在基底样乳腺癌中表达明显高于其他各组亚型。同样地，在已知ER、PR和HER2表达状态下检测FOXC1在乳腺癌组织标本中的表达，结果发现，三阴性乳腺癌组FOXC1 表达显著高于其他亚组。进一步研究发现，FOXC1仅在表达基底细胞角蛋白的三阴性乳腺癌细胞中细胞核呈强染色。统计表明，FOXC1阳性表达伴随基底细胞角蛋白表达，其敏感性0.81，特异性0.8。综上所述，FOXC1是BLBC的特异性标志物，可以成为诊断BLBC的潜在分子标志物。

2.2 FOXC1在乳腺癌发生、发展过程中的作用机制

2.2.1 促进细胞增殖的机制 FOXC1可促进肿瘤细胞增殖。研究[2]发现，将表达FOXC1的质粒转染人MDA-MB-231细胞株后，肿瘤细胞增殖能力明显增强。应用MCF-7乳腺癌细胞株也得到同样结果。有趣的是，研究中发现FOXC1高表达的MCF-7细胞在琼脂中可以呈现不依赖支持物的生长。相反地，将基因敲除的FOXC1 shRNA转导到高表达内源性FOXC1的Ⅳ期人乳腺癌鼠模型[8]中，该模型成瘤能力明显减弱。通过对BT549人乳腺癌细胞株的研究也得到同样的结果。此外，研究[2]还发现FOXC1可促进cyclin D1表达增加。在正常乳腺细胞中，cyclin D1在细胞周期G1/S期发挥限速作用。而在乳腺癌细胞中，原本在S期降解的cyclinD1被激活并高表达，导致乳腺癌细胞的G1期缩短，提前进入S期，进而细胞增殖失控，肿瘤形成。因此，FOXC1可能通过调节cyclin D1的表达参与细胞增殖的调控。

2.2.2 促进细胞浸润、转移的机制 研究发现FOXC1可促进MMP2和MMP9表达增加[2]。MMP2和MMP9是金属蛋白酶家族成员中已知与乳腺癌关系最密切的2个因子，可通过降解细胞外基质促进癌细胞浸润、转移。MMP2和MMP9可能作为FOXC1的下游靶点，参与FOXC1对细胞浸润、转移的调控。统计资料[2]表明，乳腺癌脑转移患者FOXC1表达增多，且FOXC1表达增加与乳腺癌脑转移患者数量增多成正相关。有趣的是，FOXC1虽然在乳腺癌脑转移的患者中高表达，但FOXC1并非是乳腺癌脑转移的主控基因,提示 FOXC1可能在此过程中起到协同作用。另外，研究还发现，FOXC1可促进波形蛋白、纤维连接蛋白和a-平滑肌肌动蛋白等成纤维细胞标志物的表达升高；相反，在FOXC1蛋白缺失的4T1细胞中可观察到成纤维样细胞转变成上皮样细胞的现象出现。这两项结果表明FOXC1可诱导上皮细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。上皮细胞在EMT的过程中因丧失极性，而获得活动能力，可在细胞基质间游走[9]，形成局部扩散，进而侵入淋巴管及血管，从而发生转移[10]。Bloushtain-Qimron等[11]在MCF-12A细胞株中证实了FOXC1诱导乳腺癌上皮细胞发生EMT的作用。另有研究[12]表明，在紧密连接蛋白claudin呈低表达的乳腺癌中，FOXC1过表达不仅能作为EMT的独立诱导剂，还能上调其他EMT诱导剂，如Goosedoid、Snail、Twist和TGF-β1等，这些因子协同参与EMT的发生。

2.2.3 促进血管、淋巴管发育的机制 在脉管形成过程中，FOXC1参与成血管细胞动脉分化、动脉标志物诱导和淋巴管的出芽生成。Seo[13]和Hayashi等[14]的研究表明， FOXC1通过激活Dll4和Hey2的启动子诱导动脉标志物Notch1和Dll4的过表达，并在 VEGF-Dll4-Notch-Hey2信号通路作用下共同调节动脉基因的表达。实验表明FOXC1参与成血管细胞动脉分化的调节。FOXC1和FOXC2复合突变的鼠胚胎模型表现出在主动脉弓水平，背主动脉和前主静脉融合，动脉标志物的诱导缺陷，而静脉标志物正常表达，这进一步说明突变的上皮细胞因为动脉分化失败而导致动静脉畸形的发生和血管重塑的缺陷[13]。Hayashi等[15]研究表明FOXC1还通过激活CXCR4启动子调节细胞迁移。FOXC1缺失的内皮细胞CXCR4表达下降，同时CXCL12诱导细胞迁移能力也随之下降。已知CXCR4-CXCL12信号通路可启动肿瘤原有血管生长或来自骨髓募集的表达CXCR4的内皮干细胞生长来诱导新生血管生成[16,17]。这一结果提示FOXC1可能通过CXCR4-CXCL12信号通路参与肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤转移。另外，研究[13]还表明FOXC复合突变(FOXC1+/-;FOXC2-/-)导致淋巴上皮细胞在淋巴系统形成早期出芽生成障碍。FOXC1在主静脉周围的间质细胞中表达，而这一区域是淋巴内皮细胞分化和淋巴系统出芽生成的场所。在FOXC基因突变的鼠模型中，表达Prox1(淋巴内皮细胞标志物)的淋巴内皮细胞数量明显减少，而且淋巴囊的形成也出现异常。虽然还没有FOXC1直接参与肿瘤血管及淋巴管生成的研究，但这些实验结果提示FOXC1可能在这一过程中起重要作用，但还有待进一步的研究证实。

3 FOXC1与基底样乳腺癌预后的关系

FOXC1的表达与基底样乳腺癌患者预后相关。Dejeux等[18]的研究指出，FOXC1在BLBC中通常呈现低甲基化状态，且FOXC1无甲基化的乳腺癌患者死于乳腺癌的风险高于FOXC1甲基化的乳腺癌患者。Ray等[2]根据乳腺癌患者病灶组织中是否表达FOXC1，将295例Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者分组，再依据 FOXC1mRNA水平将其分成2个亚组，分别统计各组的10年生存率。统计结果如下：FOXC1表达组与FOXC1无表达组10年生存率分别为55%和75%(P=0.0004)；FOXC1mRNA高表达组与FOXC1mRNA低表达组分别为55%和75%(P=0.0001)。实验证明FOXC1表达水平与三阴性乳腺癌患者预后呈负相关。研究者[19]再次根据BLBC的生物学分子标志物将其分为3种模型，分别为3-分子标志物模型(TNP即ER-，PR-，HER2-)、4-分子标志物模型(TNP+FOXC1)和5-分子标志物模型(TNP+CK5/6+CK14)。结果发现，与其他两组比较，4-分子标记物模型的BLBC患者5年及10年总生存率最低。4-分子标记物模型因生存率最低而对预后有重要预测价值。该实验进一步证明了FOXC1可成为BLBC的预后指标，且最有可能真实再现BLBC分子亚型的生物学特点。

基因表达谱是检测BLBC的金标准，但因成本高限制该方法在临床上的应用。免疫组化作为更经济，更便捷的检测方法被普遍采纳。然而目前国际上没有统一的界定BLBC诊断标准的免疫组化标识，建议的诊断性免疫组化标志物TNP、CKs、EGFR和c-kit缺乏特异性，不能全面反应BLBC的特点。研究表明FOXC1在BLBC中特异性表达，并在乳腺癌发生发展的过程中起着促进增殖、转移、浸润的作用，其作为免疫组化标识能更好地体现BLBC的生物学特性。FOXC1蛋白是BLBC的潜在诊断分子标志物和特异性预后生物标志物。针对FOXC1在乳腺癌形成过程中的作用，对其行以FOXC1为靶点的治疗为个体化治疗BLBC指明了方向，而FOXC1蛋白能否对BLBC有治疗意义还有待进一步的研究证实。

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