血小板活化与相关疾病的研究进展

谢晓民 陈晶

血小板由骨髓中成熟巨核细胞的胞质分割而成，是循环血液中最小的细胞，又称血栓细胞。健康人循环血液中的血小板形态、代谢与功能处于未活化状态，称为静止血小板。当血小板受刺激激活或与受损的血管壁、血管外组织接触时，外形发生改变，产生黏附、聚集和释放反应称为血小板活化。血小板活化在血栓前状态、血栓性疾病和肿瘤发生转移的诊断、预防、治疗、发病机制等方面的研究中有广泛的应用价值，综述如下。

1 血小板的结构和生理功能

血小板的表面结构由细胞外衣和细胞膜组成，糖蛋白(glycoprotein，Gp)是血小板膜蛋白的主要成分。按Gp在血小板的分布部位不同，将其分为质膜和颗粒膜糖蛋白。质膜糖蛋白主要存在于静止血小板细胞膜表面，其中以GpⅡb/Ⅲa复合物最多，且为血小板特异抗原。而α颗粒膜蛋白则主要存在于血小板胞质内的 α 颗粒(α-granule membrane protein，GMP)，颗粒(致密颗粒)和α颗粒(溶酶体)。GMP存在于静止血小板α颗粒膜上，其分子量为140 KD，故称为GMP-140。由于它属于选择素家族成员，又称P-选择素。按人类白细胞分化抗原(HLDA)的分类原则，P-选择素被命名为 CD62P［1］，它主要参与活化血小板与白细胞的黏附。

血小板是一种多功能细胞，通过黏附、聚集、释放功能参与主要涉及血管和血小板的初期止血反应，并通过分泌其颗粒中内含的多种因子、提供凝血催化表面和促进血块收缩，促进血液凝固。在动脉粥样硬化、炎性反应和免疫反应等病理生理过程中，血小板也起着重要作用。

2 血小板活化机制

循环中的血小板90%以上是静寂的，这保证了正常人不会因血小板过度活化而引起血栓性疾病。当一些激活剂如二磷酸腺苷(ADP)、凝血酶、胶原、肾上腺素、花生四烯酸等与血小板膜上相应受体结合后，可使血小板迅速活化。活化血小板膜糖蛋白迅速出现重新分布、分子结构变化等生化反应，导致血小板发生黏附、聚集，同时血小板发生释放反应，变形前藏于血小板膜内侧的GpⅡb/Ⅲa暴露于血小板表面;α颗粒受刺激向血小板膜聚拢，通过血小板开放管道系统将β-TG、PF4释放出来，同时将膜上的p选择素(以CD62p为主)融合在血小板表面外衣上，使血小板表达p选择素;溶酶体膜蛋白CD63以同样的方式转位到血小板膜表面。活化血小板与静止血小板比较，膜糖蛋白的种类、结构、功能、含量和分布特点均呈现显著变化。因此，GpⅡb/Ⅲa、CD62p、CD63均被认为是特异性血小板活化分子标志物［2］。

3 血小板活化与疾病

活化的血小板形态结构、功能、代谢均发生变化，除引起血栓外，还可促进中枢神经递质的生成，加速炎症、水肿、扩大梗死面积，参与免疫等反应［3］。

3.1 血小板活化与脑梗死 静止状态的血小板并不黏附于内皮细胞而聚集。在血管损伤和高切应力等病理情况下，血小板受刺激活化，血小板和纤维蛋白聚集成团，引起动脉血栓形成。

脑梗死最常见的原因为动脉粥样硬化，而血小板的活化在动脉硬化的发生、发展和血栓形成中起着重要的作用。由于硬化斑块或溃疡的形成，损伤了血管内皮，使皮下胶原暴露，导致大量血小板被激活，促使血小板在局部发生黏附、聚集和释放，产生血栓，堵塞血管，造成梗死。血小板膜糖蛋白在血小板黏附于血管壁及相互聚集、形成血栓的过程中起着关键作用。GpⅡb/Ⅲa复合物是纤维蛋白原的受体，参与血小板聚集反应，也是血管性血友病因子(vWF)和纤维连接蛋白(Fn)的受体，参与血小板黏附反应。在多种血栓性疾病中，血小板活化程度增高并参与疾病的发生和发展，其中活化血小板膜糖蛋白发生显著变化，特别是血小板活化依赖性颗粒表面膜蛋白 CD63、CD62p等，是血小板活化和释放反应最特异性的标志物，可作为体内血栓形成标志及体内定位诊断靶子［4-7］。

CD62p作为最特异性的血小板活化指标，在启动和扩大血栓形成中具有重要的意义［8，9］。组织缺血后的再灌注损伤产生大量氧自由基、其他内皮细胞和血小板刺激物质，释放凝血酶促使内皮细胞和血小板表达大量CD62p，血小板CD62p具有介导活化的血小板或内皮细胞与中性粒细胞及单核细胞黏附的功能，导致组织因子暴露，凝血系统活化反过来又进一步活化血小板，形成恶性循环［10］。

3.2 血小板活化与冠心病 冠心病的发病与多种因素有关，目前认为其发生和发展与血小板活化有着密切的关系［11］。在血栓形成的过程中，血小板的激活是一个重要因素。粥样硬化斑块使冠状动脉血管破损，通过多种途径激活血小板，导致血小板黏附聚集，形成富含血小板的血栓，使冠状动脉完全或部分堵塞，冠状动脉血流受限，可能引起心肌缺血，促成冠心病的发生和发展。

血小板膜糖蛋白GPIb与内皮下表层的vWF、Fn等黏附蛋白的相互结合及作用始动血小板活化过程，同时释放血栓烷A2(TXA2)、血管活性物质等，生成促凝酶。ADP、TXA2和促凝酶进一步介导循环血小板与内皮下表面黏附着的血小板相互作用，加重血小板聚集反应，收缩冠状动脉，加重血管阻塞及心肌缺血缺氧，其中内源性和外源性凝血系统被激活以及凝血酶的形成，加速了血小板聚集和纤维蛋白原向纤维蛋白的转化，对血栓形成起到生物放大作用。而GpⅡb/Ⅲa作为受体，与多种循环中的蛋白，如血浆黏附蛋白，纤维蛋白原肌纤维连接蛋白结合而聚集。在冠心病中，血小板形态变化为血小板伪足形成增多，血小板黏附性和血小板对各种聚集诱导剂(ADP、肾上腺素、胶原或花生四烯酸)的聚集反应增强，血浆中血小板释放产物［ADP、TXA2、5-羟色胺(5-HT)、β-血小板球蛋(β-TG)等］浓度升高，血小板α颗粒膜蛋白CD62p在血小板表面及血浆中的浓度增强，这充分说明血小板活化是血栓形成的重要病理机制之一。另外，动脉粥样硬化斑块导致管腔狭窄及产生紊乱，病灶组织的促血小板黏附特征有利于血小板栓子形成，而在血小板栓子形成过程中，所释放的TXA2会引起血管痉挛，与栓塞共同构成猝死的原因［12］。

3.3 血小板活化与系统性红斑狼疮(SLE) SLE是一种自身免疫性结缔组织病，由于体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物，造成组织所伤，临床可以出现各个系统和脏器损害的症状。有研究表明，SLE患者外周血CD62p和CD63表达量明显高于健康人［13，14］。这与SLE患者体内的免疫复合物沉积于关节、小血管内膜或肾小球基底膜(GBM)等部位，激活补体引起炎性反应有关。狼疮肾炎患者体内血小板和血管内皮处于高度激活状态，分泌或表达的CD62p和CD63增多，并可能介导血小板及其与之相互作用的单核细胞、巨噬细胞核T淋巴细胞等，分泌大量的正电荷和炎性蛋白，中和了GBM固定的负电荷;或分泌炎性蛋白对GBM的负电荷物质产生酶性降解作用;或分泌的炎性蛋白引起肾内血流动力学改变。通过检测血小板活化功能，还可判断SLE患者的病情轻重。

3.4 血小板活化与恶性肿瘤 临床研究表明血栓形成是目前癌症患者最常见的并发症和第二大死亡原因［15］。恶性肿瘤与止凝血功能的改变有着密切的关系。CD62p介导血小板与肿瘤细胞的黏附主要是通过其氨基末端凝集素样区域在Ca2+存在的条件下识别并结合CD62p配体而得以实现。CD62p配体都是一些寡糖基团，具有唾液酸化的氨基多糖结构或类似结构，存在于多种糖蛋白和糖脂分子上，分布于多种体细胞及肿瘤细胞表面。主要有s-lewis x，s-lewis a和CD24等。

肿瘤细胞表面可表达大量s-lewis x和s-lewis a，这类寡糖可介导肿瘤细胞与内皮细胞的直接接触。一方面，肿瘤细胞分泌的细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子、血管通透因子等可刺激血管内皮细胞，使其活化并表达CD62p［16］;另一方面，许多上皮性肿瘤可分泌粘蛋白及s-lewis x和s-lewis a抗原，后者正是CD62p的配体，活化的内皮细胞可识别它，并通过它与肿瘤细胞结合，从而促进肿瘤细胞穿过血管壁。

CD62p还可介导肿瘤细胞与血小板的结合。已证实肿瘤的转移与复发与癌栓存在与否具有很大相关性。血小板与血循环中的癌细胞结合形成“微小癌栓”，微小血栓与血管内皮细胞黏附，停留在远离器官血管中，穿出血管壁形成转移灶［17］。

4 流式细胞术(FCM)在检测血小板活化中的应用

血小板的数量与功能是临床血栓与止血检查和研究的重要内容。FCM分析血小板是临床血小板分析方法学与应用的重大发展，它开创了对单个血小板或血小板亚群分析的崭新途径。血液中的血小板体积小，与红细胞、白细胞混悬于血浆中，且极易受环境因素影响(包括各种刺激剂、受损的血管壁、剪切应力、异物表面等)而发生变形、黏附、聚集、释放和收缩反应，使血小板分析的难度增大，尤其是对体内循环血小板活化与功能的研究影响较大，因而传统的检测方法很难得到准确的实验结果。由于FCM的迅速发展和各种血小板特异性单克隆抗体的制备成功并可以直接标记荧光素分子，使得近年来FCM分析血小板逐渐从研究开始过渡到临床应用。

与传统实验方法相比，应用流式细胞仪分析血小板活化具有如下优点：(1)可以在全血中、更接近生理环境下(包括红细胞、白细胞，这两种细胞都可能影响血小板的活化)直接测定血小板活化。(2)最少的标本处理，避免了体外人为所致的血小板活化和血小板亚群的丢失。(3)既能测定循环血小板的活化状态，又可以检查循环血小板的反应性。(4)可以测定血小板特异性活化依赖的膜表面多种受体的变化。(5)一些新的单克隆抗体，直接抗血小板某些新的功能性抗原决定簇的抗体，可以很容易用于检测。(6)FCM具有极高的灵敏度，可以在全血中检出仅有1%、部分被活化的血小板亚群。(7)FCM分析血小板活化无放射性污染，主观因素较少，分析准确。

总之，血小板活化与多种疾病相关，其活化程度可由血小板膜糖蛋白表达水平的高低来判断，而应用FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况已成为检查血小板功能的一种新手段，对血小板活化相关疾病的诊断、治疗、监测有着极其重要的作用。

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