葛仙汤治疗大鼠溃疡性结肠炎

金 纯，李 霞，金 照，郑晨果，金可可，金定国

葛仙汤治疗大鼠溃疡性结肠炎

金 纯1，李 霞2，金 照3，郑晨果1，金可可4，金定国1

目的:探讨葛仙汤对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及其机制。方法:将SD大鼠按均衡随机原则分为正常对照组、模型对照组和葛仙汤低、中、高剂量组，采用大肠杆菌加乙酸免疫复合法造成大鼠溃疡性结肠炎模型。连续给药21 d，观察动物的一般情况，进行疾病活动指数（DAI）评估、结肠病理学评分(HS)，检测血清中IL-6、IL-10含量。结果:葛仙汤低、中、高剂量3个治疗组DAI和HS均明显低于模型对照组（P＜0.05或P＜0.01），IL-6含量与模型对照组比较均明显减少（P＜0.01）；中剂量组IL-6含量明显低于高、低剂量组（P＜0.05）。3个治疗组IL-10均较模型对照组明显升高（P＜0.01）；中、低剂量组IL-10明显高于高剂量组（P＜0.05）。结论:低、中、高剂量葛仙汤均能缓解溃疡性结肠炎大鼠的症状，减轻其结肠病理损伤，促进溃疡面愈合，其中以中剂量效果为更好。

葛仙汤；溃疡性结肠炎；大鼠

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种原因不明的肠道非特异性炎症性疾病，虽然临床治疗方法多样，但仍难以治愈，被世界卫生组织列为现代难治病之一。中医辨证论治为溃疡性结肠炎提供了另一条可行途径[1]。近年来我们的临床研究显示，葛仙汤（全国名中医金定国验方）治疗UC具有显著效果[2]。本研究拟使用不同剂量葛仙汤治疗大鼠溃疡性结肠炎，以探讨其可能的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 主要药品与试剂 伊红美蓝琼脂平板（广东环凯微生物科技有限公司），乙酸（温州学院附属第二医院检验科提供），联苯胺试剂盒（南京建成生物工程研究所），IL-6和IL-10 Elisa试剂盒（北京中杉公司）。中药葛仙汤组方包括葛根20 g，仙鹤草10 g，白花蛇舌草20 g，乌梅、白及、诃子各10 g，黄芪、薏苡仁各20 g，甘草10 g。

1.2 动物模型制备及分组 雄性清洁级SD大鼠,体质量160～220 g，平均（200±20）g,由温州医学院实验动物中心提供。按均衡随机原则选出10只作为正常对照组，其余按照大肠杆菌加乙酸免疫复合法制成溃疡性结肠炎模型[3]。乙酸灌肠后第2 d，将造模成功的40只大鼠按均衡随机原则分为模型对照组和葛仙汤低、中、高剂量组，葛仙汤低、中、高剂量组分别给予生药24 g/kg、12 g/kg、6 g/kg灌胃给药，相当于临床用药剂量的18倍、9倍、4.5倍。模型对照组给予生理盐水灌胃。1次/d，连续给药21 d。

1.3 标本采集 灌胃治疗结束，禁食24 h，断头处死所有大鼠。取血5 mL，离心后取血清，-20℃保存备测。剖取距肛门5～13 cm病变处结肠，沿纵轴切开，生理盐水迅速冲洗干净，置于10%福尔马林溶液中固定。

1.4 观察指标 每天观察大鼠的一般情况，包括大鼠体重、大便性状、精神状态、毛色等状况，进行疾病活动指数（disease activity index,DAI）的评估，具体指标见表1。

表1 疾病活动指数（DAI）的评估指标

结肠组织病理学评分(histopathological score, HS)：标本固定，常规石蜡包埋，切片、HE染色、光镜观察，按Sasaki等[4]提出的组织学评分标准进行组织学评分。

采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清中IL-6、IL-10含量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计，结果以均值±标准差（±s）表示。正态分布的资料组间进行方差分析，组间两两比较进行L-SD检验，非正态分布的资料按Dunnet法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 正常对照组：食量正常，体重明显增加，大便成颗粒状。模型对照组：有黏液便、脓血便，伴有明显消瘦、倦怠懒动，食量较少。2周后逐渐有所好转，体重开始回升，脓血便消失，黏液便仍存在，食欲略转好，仍有倦怠懒动。至第3周体重开始恢复到正常，反应不灵敏，大便仍不成形。葛仙汤低、中、高剂量治疗组：造模后当天与1周内的情况与模型组相似，1周后脓血便、黏液便消失，大便成形，伴有倦怠懒动、食欲减退。至第3周，体重增加，食欲较好，反应灵敏，大便状况与正常组肉眼无差别。用药3周后，低、中、高剂量葛仙汤治疗组体重均明显增加，大便次数减少，大便成型，黏液血便减轻，DAI评分均与模型对照组有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），低、中、高剂量治疗组之间比较，均无显著性差异（P＞0.05），但3个治疗组的DAI值均明显高于正常对照组。见表2。

2.2 结肠组织损伤情况及HS 用药3周后，大体观察发现低、中、高剂量治疗组结肠黏膜轻度充血、水肿，或轻度糜烂，未见明显溃疡形成；模型对照组黏膜充血、水肿，糜烂，可见到多个溃疡。镜下发现3个剂量治疗组结肠黏膜呈轻度炎症，局限于黏膜层，少量隐窝破坏，小于1/3；模型对照组呈轻度或重度炎症，病变累及黏膜或黏膜下层，1/3以上隐窝破坏。3个治疗组的HS明显低于模型对照组、高于正常对照组，低、中、高剂量治疗组之间HS比较，无显著性差异。见表2。

表2 5组大鼠疾病活动指数(DAI)和组织病理学评分(HS)比较（±s，n=10）

表2 5组大鼠疾病活动指数(DAI)和组织病理学评分(HS)比较（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.05，bbP＜0.01

组别正常对照模型对照低剂量中剂量高剂量DAI 0.07±0.11 4.00±2.31a 2.80±2.4a、b 1.82±2.53a、bb 2.00±2.36a、bb HS 0.45±0.55 5.11±1.85a 2.11±1.79a、bb 1.63±2.21a、bb 1.81±1.83a、bb

2.3 血清IL-6、IL-10含量 用药3周后，低、中、高剂量组IL-6含量与模型对照组比较，均明显降低（均P＜0.01）；中剂量组明显低于高、低剂量组（均P＜0.05）。低、中、高剂量组中IL-10均较模型对照组明显升高（均P＜0.01）；中、低剂量组明显高于高剂量组（均P＜0.05）。3个治疗组的IL-6均高于、IL-10均低于正常对照组。见表3。

表3 5组大鼠血清IL-6、IL-10含量比较（±s，n=10，μg/L）

表3 5组大鼠血清IL-6、IL-10含量比较（±s，n=10，μg/L）

注：与正常对照组比较，aP＜0.01；与模型对照组比较，bP＜0.01；与低剂量比较，cP＜0.05；与中剂量比较，dP＜0.05

组别正常对照模型对照低剂量中剂量高剂量IL-6 57.97±43.16 742.14±175.94a252.93±103.53a、b 200.87±65.98a、b、c 296.79±78.26a、b、d IL-10 98.33±32.54 22.9±8.62a52.81±7.11a、b 56.88±11.94a、b 42.99±10.84a、b、c、d

3 讨论

中医认为，溃疡性结肠炎脾虚是病之本,湿热瘀毒是病之标。治宜清热利湿,化瘀解毒，益气健脾。葛仙汤方中葛根、仙鹤草能清热利湿、化瘀解毒，为君药；薏米、黄芪清热、利湿、益气健脾,乌梅、诃子涩肠止泻，为臣药；白花蛇舌草清热解毒，白及收敛止血，为佐药；甘草和中缓急，解毒，调和诸药，为使药。诸药合用，湿热瘀毒自除，脾气健旺，达到治愈溃疡，恢复肠道功能的作用。

本实验通过复制大鼠溃疡性结肠炎模型，发现采用低、中、高剂量葛仙汤治疗均可有效改善溃疡性结肠炎大鼠的一般情况，减轻结肠炎症、充血、水肿，缩小病变范围，减少隐窝破坏，促进结肠黏膜糜烂和溃疡愈合。使大鼠大便逐渐成形，缓解脓血便和体重下降。3个剂量组之间无显著性差异，提示低剂量即可产生较好疗效。

近年研究表明，细胞因子在UC发病中起重要作用，尤其促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调所致的免疫异常是UC的重要发病机制[5]。促炎因子包括TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等，抗炎因子具有代表性的是IL-4、IL-10等。促炎因子异常增多与抗炎因子异常减少，可促进肠黏膜炎症的发生[6]。活动性UC患者IL-10的含量显著低于正常对照和缓解期[7]，但Szkaradkiewicz等[8]的研究表明，UC患者血清IL-6和IL-10均升高。本研究结果显示，模型对照组大鼠IL-6高于、IL-10低于正常对照组，提示IL-6的高表达及IL-10的低表达与结肠黏膜炎症表现一致。

促炎因子与抗炎因子的分泌及活性必须达到一种平衡状态时,机体的免疫平衡才得以维持，因此纠正与调节免疫紊乱是治疗UC的有效方法之一[6]。我们采用不同剂量葛仙汤干预,发现UC大鼠IL-6明显减少,IL-10明显增加，并与肠道炎症减轻相一致。提示低剂量葛仙汤即能有效干预UC的细胞因子之间的失衡。该实验说明葛仙汤能抑制炎性因子IL-6的释放、促进抗炎因子IL-10生成。

本研究通过不同剂量的葛仙汤治疗发现，3个剂量治疗组的DAI值和结肠组织学损伤均无显著性差异，中剂量组的IL-6含量明显低于高、低剂量组，而中、低剂量组IL-10明显高于高剂量组，提示中剂量葛仙汤对IL-6和IL-10的调节作用强于高剂量。

说明药物剂量与疗效之间有一定相关性，治疗剂量要根据机体的损伤程度作出调整，才能达到最佳疗效。本实验中使用的葛仙汤治疗剂量与炎性细胞因子的改变不同步,也说明葛仙汤对UC细胞因子的调节是复杂的，其机制以及葛仙汤对于其他炎症因子的影响如何，均有待于进一步深入研究。

[1]罗明，万恒荣，陈海生,等.白头翁汤治疗溃疡性结肠炎50例分析[J].中国中西医结合外科杂志,2010,16(4)：463-465.

[2]郑晨果，金纯，叶乐驰.葛仙汤治疗溃疡性结肠炎湿热内蕴证临床观察[J].浙江中西医结合杂志,2010,20(12):757-758.

[3]李霞，金纯.溃疡性结肠炎模型的建立与评价[J].温州医学院学报，2011，41（2）：116-121.

[4]Sasaki,Hirata,Maemura,et al.Prostaglandin E2 Inhibits Lesion Formation in Dextran Sodium Sulphate-InducedColitis in Rats and Reduces the Levels of Mucosal Inflammatory Cytokines[J].Scand J Immunol，2000,51(1):23-28.

[5]Anand AC，Adya CM.Cytokines and inflammatory bowel disease [J].Trop Gastroenterol，1999，20(3):97-106.

[6]Shih DQ,Targan SR,Mc Govern D.Recent advances in IBD patho⁃genesis:genetics and immunobiology[J].Curr Gastroenterol Rep, 2008,10(6):568-575.

[7]魏思忱,郑国启,田树英,等.IL-10在溃疡性结肠炎患者血清中的表达及意义[J].河北医药,2010,32(5):559-560.

[8]Szkaradkiewicz A,Marciniak R,Chudzicka-Strugała I,et al.Proin⁃flammatory cytokines and IL-10 in inflammatory bowel disease and colorectal cancer patients[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2009,57(4):291-294.

（收稿：2011-12-26 修回：2012-08-10）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）

Gexiantang on Treatment of Ulcerative Colitis in Rats

JIN Chun,LI Xia,JIN Zhao,et al. Depantment of

Colorectal Surgery,Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou,Zhejiang Province（325000）,China

Objective To investigate the effect of Gexiantang(GXT)on treatment of ulcerative colitis(UC) in rats and the mechanism. Method Sprague Dawleg(SD)rats were in equilibrium divided randomly into 5 groups,including control group,model group,low dosage GXT group,medium dosage group and high dosage group.UC rat model was established by utilizing combined Escherichia coli and acetate acid.After 21 days treat⁃ment,observation on rats,regular situation was done with evaluating UC rats by disease activity index(DAI),his⁃topathological score(HS)and double antibody sandwich ABC-ELISA method in the detection of serum contents of IL-6,IL-10.Results Improvement in low dosage GXT group,medium dosage GXT group and high dosage GXT group was shown comparing to the model group.Three treatment groups showed significantly lower expres⁃sion than that of the model group in DAI and HS（P＜0.05 orP＜0.01）.IL-6 levels in 3 treatment groups were significantly lower than that in the model group（P＜0.01）.Medium dosage GXT group IL-6 level showed significantly lower than that in high and low dosage GXT groups（P＜0.05）.In the 3 treatment groups IL-10 level showed higher than that in the model group(P＜0.01）.IL-10 level in medium and low dosage GXT groups showed significantly higher expression than that in high dosage GXT group. Conclusion It is suggest⁃ed that low dosage,medium dosage and high dosage GXT are all able to relieve symptoms of UC rats,to reduce colonic pathological damage,and to promote the ulcer surface healing.These are possibly related to IL6 inhibi⁃tion of inflammatory factors releasing and promoting anti-inflammatory cytokines IL-10 generation from GXT. Medium dosage GXT on effect of IL-6 and IL-10 is stronger than its higher dosage.

Gexiantang；ulcerative colitis；rats

Q95-33；R574.62

A

1007-6948(2012)05-0473-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.05.012

浙江省温州市科技局基金资助（Y20080134）

1.温州医学院附属第二医院中西医结合肛肠外科（温州 325000）

2.浙江温岭市第一医院（台州 317500）

3.浙江省温州市中西医结合医院肛肠科（温州 325000）

4.温州医学院病生教研室（温州 325035）