异种脱蛋白松质骨修复兔桡骨缺损的研究

段玉金

(晋中市榆次区第一人民医院，山西晋中 030600)

骨缺损一直是困扰矫形外科医师的一大难题，相关研究虽然较多，但目前仍没有一种令人满意的治疗方案。自体骨移植、同种异体骨、异体骨、异质成形骨替代移植在临床重建治疗中均有应用。自体骨是临床最常用的移植物，但由于供骨量的限制，且患者常出现取骨处疼痛、感染等并发症，因此，理想骨移植材料的寻求和研制一直是骨科生物材料科学领域的一项重要课题。本研究应用自制的异种脱蛋白松质骨(xenogeneic deproteinised cancellous bone，XDCB）用于新西兰大白兔桡骨中段骨缺损修复，通过观察大体标本、X线摄片、HE染色评价骨缺损的修复效果，以明确XDCB作为骨移植载体材料的可行性，为临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 移植材料制备 取新鲜成年猪(市售）股骨远端松质骨部分，截取骨块内不含软骨及皮质骨成分，初制为14mm×3mm×5mm，参照文献的方法[1-3]通过脱脂、脱钙、脱蛋白、钴60辐射消毒等物理、化学处理，制备成XDCB载体。

1.2 兔桡骨干节段性骨缺损模型的建立与修复 选用健康新西兰兔16只(复旦大学附属金山医院实验动物中心提供），雌雄不限，10w龄，体重2.0±0.2kg，桡骨长为72±3mm。所有动物均无手术区创伤、感染及双前肢畸形，也无其它全身疾病，且为同一饲养员喂养。新西兰兔双前肢前外侧直切口，暴露桡骨干，切除桡骨干中段14mm(含骨膜)，造成桡骨干节段性骨缺损模型。采用自身对照的方法，随机选取一侧桡骨为空白对照;另一侧为实验侧，植入XDCB(14mm×3mm×5mm)。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况及大体解剖观察:观察术后动物的活动、进食及伤口愈合情况。处死动物后沿原切口进入，观察局部骨痂形成、骨断端愈合情况。

1.3.2 X线摄片:分别于术后第4w、8w、12w、16w处死实验动物(各时间点随机选取4只新西兰兔），处死前各组兔摄取双前肢正位X线片(条件45kV，100mA，0.08s，焦距90cm），观察成骨情况。

1.3.3 组织学观察:处死实验动物后，各时间点新西兰兔骨标本取材，行大体观察后，经常规甲酸-甲酸钠脱钙、脱水、石蜡包埋，纵形切片，片厚5μm，HE染色，光镜下观察桡骨骨缺损的修复情况，观察分析成骨效能。

2 结果

2.1 一般情况及大体解剖观察 除1只实验兔并发双前肢骨折伴骨折端外露，经积极救治无效死亡外，余15只实验兔术后3d精神和进食恢复正常，5d活动基本正常，术肢伤口无红肿及分泌物，无切口感染、皮肤坏死等并发症。

2.1.1 空白对照侧:各个时间点均无骨组织形成，间隙充填纤维结缔组织，仅在两端形成一定骨痂，至12w桡骨干断端髓腔封闭硬化。

2.1.2 实验侧:术后4w，XDCB两端与骨断端接触面已有较好结合，植入物表面有少量白色透明软骨样组织生成，移植物形状与植入前基本一致。术后8w，植入物表面为白色透明软骨样组织覆盖，两端有骨痂生长，与XDCB骨膜延续，表面粗糙不平;12、16w，XDCB被骨痂完全包埋，植入骨与宿主骨界限消失，硬/软骨痂桥接桡骨缺损处，透明软骨样组织逐渐钙化，两端骨桥与宿主骨相连，但直径较邻近宿主骨主骨部分纤细，仍有部分支架材料颗粒。术后各时期，XDCB周围皮肤软组织未见变性、坏死等异物排异反应表现。

2.2 X线摄片

2.2.1 空白对照侧:虽在8w可见宿主骨断端有少量新骨形成，但12w、16w时X线片上均表现为骨端硬化、封闭、骨不连(图1，见封二）。

2.2.2 实验侧:术后4w时植入材料呈密度较高表现，与宿主骨之间间隙明显;8w时材料与宿主骨间模糊，可见少许骨痂生长;12w连续观察，可见XDCB表面及两侧逐渐模糊，桡骨缺损两断端间逐渐出现密度增高骨痂，XDCB体积渐缩小，密度渐接近于宿主骨;16w时，断端接合部分骨痂密度、数量明显增加，有部分出现连续性骨痂，但密度仍略小于宿主骨(图2，见封二）。

2.3 组织学观察 实验侧:术后4w，植入骨两端可见少量新生软骨及少量不成熟的骨组织，呈岛状或条梭形，可见少许软骨细胞、破骨细胞及骨细胞，有少许纤维结缔组织长入植入物中，可见少许散在多核巨噬细胞。术后8w，出现较多新生软骨及部分编织骨组织，有部分骨小梁结构出现，可见较多的软骨细胞、部分成骨细胞及胶原组织，巨噬细胞略减少。术后12w，植入骨两端与宿主骨连接处出现较多的新生软骨及部分成熟的骨组织，XDCB部分降解吸收缩小，新骨贴附植入材料生长(图3，见封二)。术后16w，新生骨进一步改建，大量新生的编织骨相互融合生长，部分可见两侧皮质间连续骨痂贯穿缺损全长，中央仍可见富含细胞的新生骨，新骨逐步改建，部分形成板层骨结构、骨小梁和髓腔结构，XDCB大部分降解吸收，仍可见部分材料残留，多核巨噬细胞仍存在(图4，见封二)。

3 讨论

骨组织工程支架材料可分为人工合成材料和天然生物衍生材料两大类。人工合成材料包括羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙(TCP)、钙磷陶(HA/TCP)、生物活性玻璃陶瓷(BGC)等生物陶瓷类和以聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)及二者的共聚物(PLGA)为代表的高分子有机合成材料。但上述材料需要特殊工艺制作，相对费用较高，并且研究发现HA陶瓷骨引导作用较差、不降解，Felsenfeld研究发现，多孔陶瓷板植入骨创面2年，其孔内仅17%为新骨组织，而44%仍为软组织，说明其应用也有一定的弊端。生物衍生骨来源包括异种骨和异体骨。异体骨的优点是成分和结构与受体相同，但异体骨同样有排斥反应，并有供体来源有限、传播疾病及伦理问题等缺点。近年来，异种骨作为骨组织工程支架材料逐渐被认识。由于异种骨具有自体骨相同的骨小梁结构，不存在供体来源受限和医学伦理问题等特点，通过脱脂脱蛋白等物理、化学方法制作异种脱蛋白松质骨(XDCB），具有人工合成材料难以相比的天然网状孔隙结构系统以及骨盐成分，保留有原骨的骨小梁、小梁间隙及骨内管腔系统[4-5]。因此，本研究选用新鲜猪股骨远端松质骨部分，截取一定大小，参照高春阳[1]、陈文斌[3]、牛云[2]等人的方法，自行制作该载体，由于制作要求较低，难度不大、费用较低，且具有一定的强度，将其作为骨组织工程支架材料载体有一定的应用前景。

已有学者[6]将XDCB作为载体进行相应的测试研究，证实该材料无机成分为羟基磷灰石，有机成分为Ⅰ型胶原，力学性能良好，免疫原性检测阴性，无细胞毒性。本研究将XDCB植入兔桡骨中段14mm骨缺损处，观察16w。其中1只兔并发双前肢骨折，考虑术中造缺损时，骨刀截取力度过大，骨刀撞击尺骨，引起尺骨损伤所致。另外15只实验兔术后活动和进食正常，未见植入物周围组织液化、坏死，切口均为一期愈合，无红、肿、热等感染并发症表现。连续行XDCB脱钙组织切片发现，4w时可见植入骨与宿主骨之间少许巨噬细胞存在，而8-16w连续观察时巨噬细胞略减少，但仍存在，未见淋巴细胞，考虑为机体正常免疫反应所致;且植入材料随观察时间延长，逐步降解吸收，可见周围组织长入其中，与宿主骨及周围组织之间相互融合，以上均说明XDCB有良好的生物相容性。

本研究发现，XDCB在4w时边缘部分开始降解，大体标本观察表面粗糙不平;组织切片观察，植入XDCB材料边缘可见破骨细胞，并在与宿主骨交界处降解部位有部分软骨组织形成，继而发生软骨内成骨，中心部位为未降解的脱蛋白松质骨无定型组织，有部分纤维连接长入。随观察时间的延长，降解区由材料边缘向中心进展，降解区无体积缺失、缩小，未形成空腔，降解材料被新生软骨或骨组织包围。各个阶段组织切片均可见多核巨噬细胞，考虑XDCB降解主要是由多核巨噬细胞吞噬吸收完成[7];Lassus等[8]也认为多核巨噬细胞有骨吸收作用。因此，本研究中XDCB植入体内后，多核巨噬细胞浸润对植入材料的降解吸收发挥了作用，同时出现新骨渐贴附材料生长，进而完成骨缺损的修复[7]。植入骨与宿主骨交界部分新生组织4w脱钙组织切片发现，宿主骨床的内外骨膜、骨髓、毛细血管等组织向植入XDCB的降解区长入，可见骨前体细胞(成软骨细胞、间充质细胞）先转化为软骨或类骨组织，后再转化为骨组织，新生骨与植入材料直接接触，彼此间无纤维组织填充。随观察时间的延长，植入材料逐渐降解吸收缩小，周围被新骨包围，并渐形成成熟板层骨和髓腔结构，考虑可能是XDCB中的羟基磷灰石降解后释放的钙离子，促使宿主骨膜形成软骨或类骨组织钙化而形成新骨包围植入骨[9]。但16w时XDCB中心仍有部分未降解，说明XDCB作为组织工程载体具有一定的生物降解性和骨传导性，亦说明该材料植入骨缺损处后呈边降解、边成骨、边改建过程，降解过程从植入骨周边处开始。

本研究参考文献制作的XDCB人工骨，体外测试具有一定机械强度，空隙率达到60-70%左右，而有关该材料的免疫原性、细胞毒性、肌肉包埋等实验已有相关文献报道，证实该材料组织相容性好，无细胞毒性[2，10]。本研究将该材料单独植入兔桡骨骨缺损处，发现其不但具有良好的生物相容性，而且具有较好的骨传导性，应进一步完善XDCB材料对骨缺损修复过程的研究，也为将其作为临床应用修复骨缺损提供实验基础。

[1]高春阳，李起鸿，简月奎，等.异种脱蛋白松质骨载体的制备及性能评价[J].重庆医学，2005，34(12):1800-1802.

[2]Niu Y, He X, Zhang LH, et al.Preparation of bio-derived bone and its histocompatibility[J].Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu, 2008, 12(7):1385-1389.

[3]陈文斌，章庆国，宋萍.以异种脱蛋白型松质骨为支架构建组织工程骨修复骨缺损实验研究[J].中国美容医学，2003，12(1):22-24.

[4]Hashizume H, Tamaki T, Oura H, et al.Changes in the extracellular matrix on the surface of sintered bovine bone implanted in the femur of a rabbit an immunohistochemical study[J].J Orthop Sci, 1998, 3(1):42-53.

[5]Lin FH, Liao CJ, Chen KS, et al.Preparation of a biphasic porous bioceramic by heating bovine cancellous bone with Na4P2O7.10H2O addition[J].Biomaterials, 1999,20(5):475-484.

[6]Lei L, Kanglai T, Liu Y, et al.Study of biological safety of scaffold material with heterogeneous deproteinized bone[J].Chinese Journal of Traumatology, 2006, 9(4): 234 - 237.

[7]李彦林，韩睿，王永年，等.部分脱蛋白骨单纯植入修复骨缺损的成骨作用[J].中国临床康复，2004，8(14):2616-2617.

[8]Lassus J, Salo J, Jiranek WA, et al.Macrophage activation results in bone resorption[J].Clin Orthop Relat Res, 1998,(352):7-15.

[9]杨志明，李彦林，解慧琪，等.生物衍生骨支架材料的组织相容性研究[J].中华整形外科杂志，2002，18(1):6-8.

[10]高春阳，李起鸿.异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体性能研究[J].中国矫形外科杂志，2005，13(6):439-442.