不同穴组针刺后哮喘大鼠肺蛋白质组的纳升级二维液相色谱分析

洪嘉婧，洪 杰，朱重玄(韩国)，郭 航，张 梦

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

针灸治疗哮喘是祖国医学防治哮喘的常用方法之一，临床上常用的针灸处方有辨证取穴、对症取穴以及邵氏“三穴五针”法等[1]。本课题应用纳升级多维液相色谱技术，对照研究不同针灸穴组防治哮喘的治疗效应，分析针刺后不同针灸穴组产生的差异蛋白，以期阐明其效应物质基础及其疗效差异。

1 材料与仪器

1.1 试剂 乙腈(ACN)、甲酸(FA)、胰蛋白酶(Trypsin)、牛血清白蛋白(BSA)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、醋酸铵(NH4AC)。

1.2 实验仪器 Agilent1100纳升级多维液相分析系统(Agilent，USA)。

2 方法

2.1 实验动物及分组 清洁级雄性Wistar大鼠，体质量(130±30) g(吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供，实验动物合格证号：0001468)。将56只大鼠随机分为7组,每组8只：A.空白对照组；B.捆绑组；C.假手术组；D.哮喘模型组；E.三穴五针组(大椎、双风门和肺俞)；F.郄会配穴组(膻中、双孔最)；G.降气平喘组(膻中、双孔最和丰隆)。

2.2 模型复制方法 大鼠哮喘模型复制依据实验室方法：D、E、F、G 4组大鼠一次性腹腔注射含卵蛋白0.25 kg和氢氧化铝凝胶0.25 kg的生理盐水混悬液0.001 5 L以致敏；15 d后将以上4组大鼠麻醉后固定于手术台上，行气管插管术,并经颈外静脉注射含卵蛋白的生理盐水溶液以激发哮喘发作。捆绑组仅作抓取，捆绑；假手术组的腹腔注射和颈外静脉注射均用如上等量的生理盐水；空白对照组大鼠不做任何处理，正常饲养。

2.3 选穴和针刺 选穴参照大鼠常用针灸穴位定位标准[2]。针刺方法:选用15 mm/0.30 mm毫针，从造模的第1天起针刺，膻中平刺5 mm，孔最、丰隆斜刺5 mm，大椎斜刺5 mm，肺俞、风门斜刺5 mm，各穴均捻转10 s，每隔10 min行针1次，留针20 min，隔日治疗1次，7次为1个疗程。模型组和捆绑组每日同样抓取，不针刺；空白组正常喂养,不予处理。

2.4 样品制备

2.4.1 大鼠肺组织蛋白提取 取大鼠左肺尖以1 g：8 mL的比例加入1 mmol/LPMSF溶液，所得匀浆冰浴混悬20 min后离心10 min，收集上清液。

2.4.2 大鼠肺组织匀浆液的总蛋白含量测定 采取Bradford法，以牛血清白蛋白作为标品，用紫外分光光度计进行定量。

2.4.3 酶解反应 将样品用碱性水溶液调节其pH值至7.5～8后，煮沸4 min，加入15%乙腈，冷至室温，加胰蛋白酶，使样品与胰蛋白酶的质量比为40∶1。37 ℃水浴条件下过夜后，滴入甲酸以终止酶解反应，所得样品即可上样。

2.5 蛋白质酶解物的纳升级二维液相色谱分离 第一维强阳离子交换色谱柱：AgilentZORBAX，流动相A：H2O-ACN-FA(体积比为98∶2∶0.1)。洗脱液为2 mol/L的NH4Ac,洗脱10 min，流速：10 μL/min。富集柱：C18柱为AgilentZORBAX。

2.6 统计学处理 应用SSPS 13.0统计软件进行数据处理。多组之间采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。

3 结果

3.1 模型组与空白组比较 在保留时间20～80 min之间，消失的峰为6号，新出现的峰为2号、8号，有可能是新物质；提示造模成功后,哮喘组大鼠与空白组相比有新的特异性物质产生，即该部分多肽可能与哮喘发病有关系。

3.2 模型组与捆绑组比较 有1个峰消失(6号)，3个多肽峰的峰面积(5、7、8号)有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；提示捆绑也是一种刺激。

3.3 3个针刺组与模型组比较 1)有3个多肽峰(1、2、5号)为共有峰。2)有3个多肽峰的峰面积(3、6、8号)有统计学意义。3)有1个新出现的峰(3号),可能是新物质；提示针刺后出现的特异性多肽谱峰的相关蛋白可能是针刺防治哮喘的相关蛋白。

3.4 3个针刺组之间比较 1)郄会配穴组、降气平喘组与三穴五针组相比,均有以下特点：共有峰5个，其中4个的峰面积(1、5、7、8号)有统计学意义。2)降气平喘针法组与郄会配穴组相比，有3个多肽峰的峰面积(5、7、8号)有统计学意义。提示采用不同配穴方法针刺后，哮喘大鼠的肺组织蛋白酶解液存在差异性蛋白表达。3)3个针刺组的共有峰(5、7、8号)面积相比较，呈依次递增的趋势，表明采用不同配穴可影响这3种多肽的含量,并且降气平喘组特异性多肽的峰面积最大,平喘作用最强，提示针刺对哮喘的治疗机制可能与这3种多肽的含量有关，且含量越多，疗效越好。

4 结论

针灸效应可通过不同组织蛋白成分的变化予以监测，nano-2D-LC技术能通过蛋白质在种类和表达量上的改变来探讨针灸治疗哮喘的效应机制。本实验采用纳升级的流速，使样品的分离效果更好。经过对不同检测波长进行考察和比较，本实验采用214 nm作为检测波长。针刺体表穴位所产生的肺组织的特异性蛋白表达，揭示了经穴与相应脏腑具有特异性联系。

[1]洪嘉婧,王富春,严兴科,等.针灸治疗哮喘的临床取穴规律研究[J].长春中医药大学学报,2011,27(3):372-373.

[2]林文注.实验针灸学[M].上海:上海科学技术出版社,1994:287.