副猪嗜血杆菌病研究进展

耿万友，付作宽，周 霞，王学理，杜立银

（1.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽028042；2.科尔沁区食品药品监督管理局，内蒙古通辽028042）

副猪嗜血杆菌病（Haemophilosis parasuis，HPS）是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一种泛嗜性细菌性传染病，早在1906年由德国学者Gllisser发现，故又称“革拉瑟氏病”（Gllisser＇s disease）［1］。本病以纤维性多浆膜炎、脑膜炎和多关节炎为主要特征，并伴有发热、咳嗽、呼吸困难、共济失调和被毛粗乱等症状。Hps主要侵害仔猪尤其是早期断奶仔猪，4周龄～8周龄的猪对Hps也较敏感，本病的发病率一般在10%～20%，病死率有时可高达50%。

本病呈世界性分布，据不完全统计，有38.9%～77.8%的猪携带潜在的致病菌［2］。我国也从规模化养猪场中分离到了该病原菌。Hps感染已经成为早期断奶仔猪和高度健康猪群的威胁，严重的影响了地区及世界经济的发展，现将近几年关于副猪嗜血杆菌病的研究进展阐述如下。

1 病原学

副猪嗜血杆菌（Hps）是革兰阴性、非溶血NAD依赖性短小杆菌，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属中的成员。在显微镜下Hps呈球形、棒状或丝状，无鞭毛、芽胞，通常可见荚膜，美蓝染色呈两极着色。Hps对pH变化和热应激都非常敏感。Hps生长缓慢，而且对于营养物质的需求也特别挑剔，有时需要加入特定的X、V等生长因子，这些条件就使得对Hps感染样本的采集、恢复以及运输造成很大的困难。一般使用巧克力琼脂板，在温度为37℃、体积分数为5%的CO2条件下进行培养，最适pH为7.6～7.8。Hps对外界环境的抵抗力不强，干燥环境可使其死亡，一般在60℃经5min～20min内死亡，常用的消毒药物也可将其杀死，4℃下可存活7d～10d［3］。

根据表性特征和致病能力，应用传统的血清学方法可将副猪嗜血杆菌分为15个标准血清型，但是由于有限的分辨率和不同实验室间结果比较的困难，仍然有一部分临床分离菌株不能用血清学方法分类定型，这就表明还存在其他血清型的可能［4］。同时由于未定型的菌株和标准血清型菌株毒力多变性的存在，使血清型分类方法也存在一定的局限性。但是值得注意的是必须有效控制地区流行的血清型，因为不同血清型甚至是同一血清型不同菌株之间的致病力、疫苗的交叉保护以及预防治疗都存在很大的差异，比如血清型2菌株Bakos A9，血清型14菌株H792和血清型4菌株9904108是没有致病力的，但血清型2菌株SW124和血清型4菌株SW140与腹腔接种相比，鼻内接种以后，可以起到保护治疗的作用。相反，无毒性的血清型7和11能从感染Hps的猪的鼻液中分离得到，而且用血清型7菌株373／03A鼻内接种，可使1／6的猪复发［2］。

有许多分子生物学方法应用到Hps的血清型分类中，如限制性核酸内切酶图谱法、双酶切电泳法 、重复基因共有序列PCR、外膜蛋白图谱等，Del Rio M L等［5］在对比应用协同凝集试验（CA）和间接血凝试验（HIA）检测各种临床分离株血清型的试验中发现HIA在敏感性和特异性上都是一种很可靠的Hps分型方法。但也有人认为有些分离株因为特别难生长或者生长缓慢而不能从鼻拭子中得到，比如血清型12，也有一些是因为异源性的存在给临床分类带来了困难［6］。Hps从强毒株到无毒株都有分布，现在15种血清型中最流行是4型和5型，其次是13、14和12型。1、5、10型毒力最强，8型和15型为中等毒力，认为3型和6型与临床症状无关。但是到目前为止，毒力的分子基础还未确立，血清学、吞噬抑制和内皮细胞的入侵可能都与Hps的毒力有关［7］。

2 流行病学

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道共生菌，也是早期寄生在小猪鼻液中的细菌之一，可以通过拭子从感染Hps猪的鼻腔、扁桃体和气管中分离得到。但是为了能够分离到致病性的Hps以及对分离到的Hps进行分类定型，一般建议不使用拭子，因为这样常常会分离到非致病性的Hps，一般都从病死猪尸体的心脏、肺脏和脑等组织或腹腔液、脑室液、心包液及关节液中分离致病菌［8］。病猪和携带致病菌的猪是主要的传染源。本病主要通过空气经呼吸道传播，病原也可以经过排泄物、分泌物等污染饲料和饮水。有人发现经产母猪的胎衣等分泌物中Hps的含量要比初产母猪高出许多［9］。另外，生长环境的恶劣、营养不良、天气的突变、不同日龄猪的混养、提前断奶、转群以及运输等各种应激因素都有可能是诱发本病的原因［10］。

副猪嗜血杆菌只感染猪，具有很强的宿主特异性，未经免疫的或是4周龄～8周龄的保育猪都容易感染。曾经有人认为本病是仔猪的散发性、应激性疾病，然而无特定病原体种群的建立，增加了本病在全世界范围内的流行［11］。本病的发生主要与各种应激反应导致猪的抵抗力下降有关系，在一定范围内，健康猪也携带Hps，即使是无HPS暴发的猪场。如果猪群存在其他的传染病，导致抵抗力下降时，使猪群更加易感Hps，致使病情更加复杂化，而且由于HPS复杂的流行病学，不同猪场间带菌猪分布的多变性，给临床诊断和治疗都带来了很大的困难。

3 临床症状

根据临床症状和病程，感染Hps的临床症状可以是急性的，也可以是慢性的，这主要取决于炎性损伤的部位和种群整体的免疫状态，一般高度健康的猪群，发病很急，接触病原后几天内就会发病，随后可能出现死亡［12］。

3.1 急性型

一般膘情良好的猪会突然发病，体温升高至40.5℃～42℃，精神沉郁，食欲下降，咳嗽，呼吸困难并表现为腹式呼吸。体表皮肤发红，耳稍发紫，指压不褪色。有时腕关节和跗关节会发生炎症，驱赶时病猪发生尖叫，共济失调［13］。临死前常常侧卧或四肢呈划水样，一般无明显症状而突然死亡，有时发病1d～5d死亡。

3.2 慢性型

多发生于保育阶段的猪，常由急性型转化而来，一般呈慢性经过，病猪多见关节和后腿明显肿胀，生长不良，衰弱，被毛粗乱，出现间歇热，结膜发绀，随后全身发紫，站立不稳，有时头顶墙角而不能收回，进行性消瘦，有时甚至是因衰竭而死亡，同时也易受沙门菌、多杀性巴氏杆菌等其他病原微生物的侵害而发生继发或并发症［14］。

4 病理变化

4.1 病理剖检变化

病猪皮肤发绀，耳背面尤为明显。主要特征为多纤维性浆膜炎和多关节炎，全身淋巴结肿大、出血，切面多汁外翻。胸腔积液呈淡红色并伴有大量纤维素渗出及凝血块。肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，膨胀呈暗紫红色，充血、出血，有时表面还覆有纤维素性渗出物，常常与胸壁粘连。在病程较长的病例中，常常因为炎性渗出物，使心外膜和心脏粘连在一起，形成明显的“绒毛心”，成为本病最具特征的病理变化［15］。病死猪脾脏肿大，体积为正常的2倍～3倍，周边出现坏死灶，切开肿大的关节，有大量纤维素性渗出物。此外，有时肾脏和肠道也有明显的病理变化。

4.2 病理组织学变化

4.2.1 心脏 表面有大量的纤维素渗出，其中含有大量的单核细胞、淋巴细胞、浆细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞浸润。表层心肌纤维肿胀，排列紊乱，断裂，细胞肿胀及坏死。间质毛细血管充血，有炎性细胞浸润。

4.2.2 肺脏 呈纤维素性胸膜肺炎，有浆液渗出，支气管、肺泡内有大量的炎性细胞浸润，其中以中性粒细胞为主。原有的肺脏被膜消失。肺小叶严重充血、出血，有大量红细胞渗出，并伴有炎性细胞浸润［16］。

4.2.3 脾脏 脾炎，表面有网状纤维素渗出，其间有大量的炎性细胞和少量红细胞。结缔组织增生、水肿，血管扩张充血，平滑肌纤维肿胀、崩解，脾脏实质内白髓体积缩小，边缘区和红髓出血。有时脾小体的生发中心也变小甚至观察不到生发中心［17］。

4.2.4 肝脏 表面有纤维素渗出，其间有大量中性粒细胞、淋巴细胞和浆细胞，常常由于中性粒细胞的崩解而形成脓肿。肝细胞肿大、坏死，形成坏死灶，中央静脉扩张充血，肝血窦内皮细胞脱落，肝小叶间质血管扩张充血，局部小叶间质增生［18］。

此外，有时也伴随有脑膜炎，肠道炎症的发生，而且有中性粒细胞等炎症细胞的浸润。

5 诊断

根据流行病学、临床症状和病理变化可做出初步诊断，确诊还需要做进一步的细菌分离鉴定。通常实验室可以无菌采集病死猪心脏、脾脏、肺和淋巴结等处病料，无菌接种于巧克力琼脂板上，然后垂直于划线接种金黄色葡萄球菌，在温度为37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养48h，可见明显的“卫星现象”，有助于对本病的诊断。另外，还可以对原代培养的病原菌进行PCR鉴定，也可以通过琼脂扩散试验、补体结合试验和间接血凝试验等血清学方法做进一步确诊［19］。

Turni C等［6］通过用编码2个转录抑制因子（IF2-IF2α）和（IF2β）的InfB基因为靶基因，利用实时PCR对Hps野外株的诊断获得了较理想的效果。与存在特异性问题的常规PCR相比，实时PCR对于HPS的诊断结果非常可靠，因此实时PCR的高特异性和敏感性成为诊断HPS非常有效的方法，这一方法的应用也将提升实验室诊断HPS的能力，特别是不具备Hps培养的实验室。

Olvera A等［2］通过试验证实Hps中含有一个与毒力相关的自身运载体（vtaA）基因，而且通过分析它们的转运区域，可以将这一基因分成三部分，基因组杂交比较结果显示vtaA-3具有高度的保守性，因此以vtaA基因为靶基因，利用多重PCR可以有效的诊断出Hps的感染以及区分出分离株中非致病性菌株的存在。也有人以16SRNA基因为靶基因来诊断Hps的感染，但是结果较其他方法存在一定的差异［17］。最后要做出正确的诊断，还需要临床工作者丰富的诊断经验，结合临床症状和病理变化做出科学的诊断结果。

6 防控

6.1 预防

目前对本病的预防还存在一定的局限性，只能从日常的饲养管理和疫苗免疫等方面着手，到现在为止，还没有一种特效的多价疫苗能够有效地预防本病的发生，而且由于致病菌的多变异性，疫苗的交叉保护也很差。

先天免疫反应是脊椎动物防御病原微生物入侵的第一道防线，这期间起主要作用的是中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞等吞噬细胞，其中巨噬细胞做为先天免疫的主要成分，对宿主防御病原微生物的感染起着至关重要的作用，通过释放细胞因子和趋化因子，维持宿主的免疫反应［12］。因此，可以从以下几点保护宿主的先天免疫，预防本病的发生。

6.1.1 严格执行日常的饲养管理制度 保持圈舍内外良好的卫生环境，温度、湿度适宜，通风良好，饲养密度适中，不同日龄的猪不混养。还要对外来车辆和人员进行严格的消毒，以免带入外源性致病菌株。另外还要坚持“全进全出”，发现疑似病例要马上隔离或捕杀淘汰，并进行环境消毒和疫苗免疫，以防病原菌的传播扩散。

6.1.2 药物预防和免疫接种 定期在饲料和饮水中加入一定量的庆大霉素、氟苯尼考、阿莫西林等抗生素可以有效的预防该病的发生，疫苗的使用也是有效控制此病发生的方法之一，但是由于该病的病原菌血清型较多，致病菌株多样性的存在，不同血清型之间疫苗的交叉保护较差等原因，最好使用副猪嗜血杆菌多价灭活苗，有条件的猪场可以采集本场的病料制做自家苗，以更好的预防本病的发生。

OMPA是革兰阴性菌的主要外膜蛋白，具有高度保守性，它的主要功能是参与细胞膜的形成、噬菌体结合、细胞生长和侵害哺乳动物细胞等，Hps也含有这种蛋白。有研究表明，免疫接种血清中抗体能定向对抗OMPs，而且OMPs的免疫原性较Hps的其他成分都高，所以OMPA有可能成为治疗HPS亚单位疫苗的候选者［20］。

6.2 治疗

近些年来，由于断奶的提前和三点生产方式的使用等生产方式的改变，使Hps感染成为引起高死亡率、给养殖业造成巨大经济损失的主要原因，特别是对无特定病原菌的猪群［21］。当猪群中出现临床症状或严重的病理变化时，许多抗生素的治疗效果都不是很理想，仅能控制症状的进一步恶化。而且不同血清型之间对同一种抗生素的敏感性也存在很大的区别，在用药治疗前最好先对分离菌株做药敏试验，以选择最好的药物进行治疗。

Guo L L等［11］在研究氟喹诺酮抵制Hps的分子特征试验中，发现深入理解氟喹诺酮抵制Hps的机制可以有效的控制和治疗Hps感染。然而由于血清型的多样性和一部分非致病性菌株的存在，没有可以提供有效交叉保护免疫的疫苗，因此抗菌药物的应用成为日趋重要的有效抵制此病原体的方法。不幸的是，氟喹诺酮的广泛使用许使多国家的Hps产生了耐药性。到目前为止，尚未阐明氟喹诺酮抵制Hps的机制，但相信可以为以后的进一步研究提供科学依据。

Tian H B等［3］在应用ELISA方法探讨MAb1D8与Hps血清型反应敏感性的试验中发现中和性MAb1D8能够与所有的15种和野外分离株HLJ-018反应。相比之下被动免疫结果也表明用1D8腹腔内接种小鼠，能够有效地抵制Hps在血液、肺、脾、肝等处的寄居，而且还能够延长生存时间。此外，被动转运试验表明，MAb1D8能够使小鼠免受同源或异源性Hps的攻击。对于内源性致病菌的攻击，疫苗是一条有效地控制方式，但是在交叉保护试验中也出现了变异，因此必须寻求新的治疗方法。

7 结语

迄今为止，研究人员已对HPS进行了一系列的研究探索，也取得了许多显著的成就，但是仍有许多问题尚未解决，比如许多分离株的血清型还不能分类定型，Hps感染的分子基础也不十分清楚，在实践中PCR方法和Southern blot方法的应用也存在困难［19］。这些难题都需要科学工作者进一步的研究探讨，以更加深入的了解HPS和寻找到一种更好的诊断治疗方法。

以前认为本病只会在应激条件下的猪只中发生，但是现在也有无应激猪只发病的报道，这可能是因为一种非致病性血清型的流行影响了其他致病菌株的检测，因而健康猪只不适宜用于所有血清型的检测，另外，样本量的大小对于一个农场中所有血清型的检测也是非常重要的。

近些年来以蛋白质为基础的疫苗备受关注，通过免疫保护分析，鉴定出许多具有免疫原性的OMPs，这对于单价和多价亚单位疫苗的生产是至关重要的，但是有报道称Hps OMPA诱导的免疫反应是有限的，还有待于进一步证实。另外，通过观察基因图谱可以筛选出潜在的宿主代理，可以减少Hps的流行和进一步理解Hps的致病机制。

［1］ Turni C，Pyke M，Blackall P J.Validation of a real-time PCR for Haemophilus parasuis［J］.J Appl Microbiol，2010，108（4）：1323-1331.

［2］ Olvera A，Pina S，Macedo N，et al.Identification of potentially virulent strains of Haemophilus parasuis using a multiplex PCR for virulence-associated autotransporters（vtaA）［J］.Vet J，2012，191（2）：213-318.

［3］ Tian H B，Fu F，Li X S，et al.Identification of the immunogenic outer membrane protein a antigen of Haemophilus parasuis by aproteomics approach and passive immunization with monoclonal antibodies in mice［J］.Clin Vaccine Immunol，2011，18（3）：1695-1701.

［4］ Guo D Q，Tang C，Hai Q，et al.Development of a universal plate-agglutination test for detecting Haemophilus parasuis［J］.J Vet Sci，2010，11（4）：355-357.

［5］ Del Río M L，Gutierrez C B，Rodríguez Ferri E F.Value of indirect hemagglutination and coagglutination tests for serotyping Haemophilus parasuis［J］.Am Soc Microbiol，2008，2（41）：880-882.

［6］ Turni C，Blackall P J.Serovar profiling of Haemophilus parasuis on Australian farms by sampling live pigs［J］.Aust Vet J，2010，88（7）：255-259.

［7］ Aragon V，Cerda-Cuellar M，Fraile L.Correlation between clinico-pathological outcome and typing of Haemophilus parasuis field strains［J］.Vet Microbiol，2010，142（3）：387-393.

［8］ Yue M，Yang F，Yang J，et al.Complete genome sequence of Haemophilus parasuis SH0165［J］.J Bacteriol，2009，191（4）：1359-1360.

［9］ Jablonski A，Zebek S，Kolacz R.Usefulness of PCR／RFLP and ERIC PCR techniques for epidemiological study of Haemophilus parasuis infections in pigs［J］.Pol J Vet Sci，2011，14（1）：111-116.

［10］ Olvera A，Calsamiglia M，Aragon V.Genotypic diversity of Haemophilus parasuis field strains［J］.Appl Environ Microbiol，2006，25（3）：72，3984-3992.

［11］ Guo L L，Zhang J M，Xu C G.Molecular characterization of fluoroquinolone resistance in Haemophilus parasuis isolated from pigs in South China［J］.J Antimicrob Chemother，2011，66（1）：539-542.

［12］ Liu X D，Chen H B，Tong Q，et al.Molecular characterization of caveolin in pigs infected with Haemophilus parasui［J］.J Immunol，2011，186（2）：3031-3046.

［13］ Liveira O，Pijoan S.Haemophilus parasuis：new trends in diagnosis，epidemiology and control［J］.Vet Microbiol，2004，99（1）：1-12.

［14］ Yu J，Wu J，Zhang Y，et al.Concurrent highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection accelerates Haemophilus parasuis infection in conventional pigs［J］.Vet Microbiol，2012，158（3-4）：316-321.

［15］ Luppi A，Bonilauri P，Dottori M，et al.Haemophilus parasuis serovars isolated from pathological samples in northern Italy［J］.Transbound Emerg Dis，2012，5（8）：3-7.

［16］ Wang Y，Liu C，Fang Y，et al.Transcription analysis on response of porcine alveolar macrophages to Haemophilus parasuis［J］.BMC Genomics，2012，13（68）：1-13.

［17］ Blanco I，Galina-Pantoja L，Oliveira S，et al.Comparison between Haemophilus parasuis infection in colostrums-deprived and sow-reared piglets［J］.Vet Microbiol，2009，103（1-2）：21-27.

［18］ Elicker S，Sipos W.Compatibility of a combined vaccination against Haemophilus parasuis and porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Berl Munch Tierarztl Wochenschr，2009，122（9-10）：354-357.

［19］ Oliveira S，Galina L，Pijoan C.Development of a PCR test to diagnose Haemophilus parasuis infections［J］.J Vet Diagn Invest，2001，13（6）：495-501.

［20］ Chu Y F，Gao P C，Zhao P，et al.Genotyping of Haemophilus parasuis isolated from northwest China using PCR-RFLP based on the ompA gene［J］.J Vet Med Sci，2011，73（3）：337-343.

［21］ Aragon V，Cerda-Cuellar M，fraile L，et al.Correlation between clinico-pathological outcome and typing of Haemophilus parasuis field strains［J］.Vet Microbiol，2010，142（3-4）：387-393.