RNA干扰的研究现状与应用前景

陈贵元，谭德勇

（1.云南大学生命科学院生物化学与分子生物学实验室，昆明 650091；2.大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室，云南大理 671000）

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物进化过程中遗留下来的一种在转录后通过小RNA分子调控基因表达的现象〔1〕。它由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）启动，在Dicer酶的参与下，把RNA分子切割为小分子干扰RNA（small interfering RNA/shortinterfering RNA，siRNA），并特异性地与mRNA的同源序列结合，从而产生相应的功能表型缺失的现象。根据dsRNA作用效果分为3种类型：阻抑作用、部分降解和完全降解，其共同特点都表现为抑制作用，以达到降解或者关闭特定基因表达的目的。RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被赋予不同的名称，在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression），在真菌中被称为基因阻抑（qulling），而在动物体内被称为RNA干扰〔2-3〕。RNA干扰现象是Fire和Montgomerym〔1〕在1998年2月发现的，他们将体外转录得到的纯化后的单链RNA和经纯化的双链RNA分别注射线虫时发现，单链RNA对基因抑制效应十分微弱。相反，双链RNA则能高效特异性地抑制相应基因的表达。真菌、植物、水螅、涡虫、锥虫（Trypanosoma brucei）和小鼠等大多数生物中均存在RNA干扰现象〔4-6〕。2001年，Elbashir等〔7〕首次用长度约为19～23个碱基对的双链siRNA在哺乳动物细胞中诱发基因沉默现象，证实哺乳动物细胞中也普遍存在RNA干扰机制，从而引起RNA干扰的研究热潮。由于几乎所有的物种都保留着RNA干扰的机制，这揭示了RNA干扰很可能是出现于生命进化的早期阶段，而且起着重要的作用，RNA干扰也越来越为人们所重视。本文对当前RNA干扰的研究进行了总结并对其应用前景作了简要介绍。

1 RNA干扰的作用机制

虽然科学家们运用遗传学和生物化学的方法来探索RNAi的机制，但RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，其真正的机理尚未明了。目前认为其可能分为以下几个阶段进行〔1，8〕。

起始阶段。dsRNA进入细胞，被Dicer核酸酶特异识别，以一种依赖ATP的形式将dsRNA切割成长约21～23 nt（或bp）的小片段siRNA，siRNA又被称为引导RNA （guide RNA），是识别靶RNA（target mRNA）的标志，siRNA的生成启动了RNA干扰反应。

效应阶段。siRNA通过与核酸酶等蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC），并依靠ATP提供能量解开siRNA双链，激活RISC。活化后的RISC定位到与siRNA中的反义链互补的靶mRNA转录本上，并在距离siRNA3′端12个碱基的位置切割mRNA，使靶mRNA降解。在RNA干扰的效应阶段，RISC复合物起了相当重要的作用。siRNA与RISC复合物形成一种小干扰核糖蛋白粒子（small interfering ribonucleo protein particles，siRPP）。RISC与Dicer都具有RNA酶的活性，但是它们的底物却不同，RISC常常针对单链RNA分子，而Dicer则针对双链RNA分子。另一方面，它们酶切RNA分子的方式和酶切的产物也不同，Dicer属于RNA内切酶，而RISC则属于RNA的外切酶。因此，它们是性质和功能各异的两种酶类复合物。

放大效应。RNA干扰效应阶段的mRNA降解产物，反过来可以作为依赖RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP） 的RNA模板，合成双链RNA分子，加入到RNA干扰的启动阶段，从而放大RNA干扰的作用〔9〕。也就是说，在RNA干扰的启动和效应阶段，都存在着siRNA的扩增和RNA干扰的放大效应。另一方面也说明，RNA干扰的启动和效应阶段并不是两个绝对独立的过程，而是相互交错进行的。

2 RNA干扰的作用特点

2.1普遍性RNA干扰的机制广泛存在于不同物种的细胞内，植物、微生物、动物的细胞内都保留了运行RNA干扰的酶类〔10〕。把长的dsRNA或短的siRNA导入生物体细胞，都可激发RNA干扰、沉默基因表达。在细胞培养和动物模型的实验中都证实，siRNA可在多种器官的细胞中，包括肝脏、脾脏、肾脏、血液系统、视网膜、神经系统、胚胎和造血干细胞等抑制特异基因的表达。此外，几乎所有的基因都能通RNA干扰而被沉默〔4〕。

2.2 RNA干扰的高效性和浓度依赖性RNA干扰抑制目标基因表达的效能非常高，无论是在体内还是体外试验中，仅需少量的siRNA就能有效地抑制大量靶基因的降解。宋尔卫等〔11〕对Fas抗原的siRNA治疗小鼠暴发性肝炎模型实验中，siRNA的用量比过去文献报道的反义寡核苷酸的用量少10倍以上，但是却能达到同样的抑制效果。这种高效强大的基因抑制功能主要是与RISC降解mRNA的效能强大。siRNA是否能够比较容易接近mRNA靶目的片段与siRNA分子的稳定有关。另外，RNA干扰效应的强度随着siRNA浓度的增高而增强〔12〕。

2.3高度特异性由dsRNA诱导的RNA干扰只引起与dsRNA同源的mRNA降解，对其它基因的表达不受影响，这是RNA干扰最显著的特征〔13〕。因为siRNA对mRNA降解的选择取决于siRNA的特异序列，所以siRNA是严格按照碱基配对的法则与靶mRNA结合。RNA干扰的特异性，不仅是siRNA应用于基因研究时能准确剖析具体基因功能的前提条件，也是它用于治疗疾病时药效强大、药效专一、不良反应小的基本保障。

2.4可遗传性和时间效应RNA干扰效应可以稳定地遗传给子代，而且存在时间上的效应。1998年Fire等〔1〕在实验中发现：在线虫中，通过注射的方式将siRNA注射到线虫中能把RNA干扰的现象传给第2代，但不能传给第3代。而将dsRNA转染到体外培养的细胞后，其功能缺失的表型可以持续9代。哺乳动物细胞中的siRNA干扰具有时间效应，注入dsRNA 2～3 d内，RNA干扰显著，接下来的1～2 d内，靶mRNA的丰度就能恢复到RNA干扰前的水平。RNA干扰作用的下降甚至消失，可能是由于siRNA活性下降，能被siRNA识别的序列发生点突变或者产生抗siRNA的抗体所至。

2.5可传播性RNA干扰信号可以穿越细胞界限，向其它的组织细胞扩散，引发系统性应答。植物中RNA沉默的一个最显著特征是通过植物大分子运输系统进行系统扩散。植物大分子运输系统有通过胞间连丝（plasmodesmata）进行的细胞间运输和通过韧皮部（phloem）转运系统进行的长距离运输。在植物中，RNA干扰信号可以通过胞间连丝或脉管系统在细胞间传递。而在动物中，RNA干扰信号的扩散需要特殊蛋白参与，在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。Feinberg和Hunter〔14〕通过对sid-1基因（系统性RNA干扰缺陷基因，可以编码的蛋白质含有11个跨膜结构域）的研究发现：线虫细胞膜上的sid-1可以将双链RNA转运出细胞，双链RNA也可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。在人体和小鼠基因序列中也含有sid-1同源基因，这表明哺乳动物体内也存在全身性的RNA干扰的现象。

2.6 ATP依赖性有研究表明，去除ATP或者抑制ATP合成的复合体的样品中，RNA干扰现象降低或消失，显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程〔15〕。因为ATP能提供Dicer和RISC的酶切反应所需的能量。研究还发现，人的Dicer酶优先在dsRNA的终末端剪切dsRNA而不需要ATP的参与。这是否表明ATP只对RNA干扰中的某些阶段起作用，还有待于更多的实验来证明。

3 RNA干扰技术的应用前景

3.1基因功能研究上的应用RNAi能够在真核生物细胞中抑制特异性基因的表达，产生类似基因敲除的效果。随着现代生物基因测序技术的发展，大量未知功能的新基因不断被发现，研究这些基因的功能是当前生物科学研究的主要方向之一。RNA干扰技术将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基敲除技术相比，RNA干扰技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。随着对RNA干扰机制研究的不断深入，RNA干扰技术将成为研究基因功能不可或缺的工具。

3.2 RNAi在基因治疗方面的应用RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动等作用。因此RNAi可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。肿瘤的发生是多个基因相互调控作用“失灵”的结果，当前对肿瘤的治疗是通过物理和化学的方法抑制DAN复制及细胞分裂增殖，进而杀死癌细胞，然而这些方法不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长。而RNAi可以利用同一基因家族中多个成员具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一序列的dsRNA分子，只导入一种dsRNA即可以使多个基因同时沉默，从而捉使癌细胞生长停滞。

3.3 RNAi功能基因组研究上的应用在功能基因组研究中，需要对特定基因进行沉默使其功能丧失。利用RNAi高度序列专一性的特点，设计出dsRNA可以特异地使特定基因沉默，从而使特定基因的功能丧失。因此RNAi可以作为一种强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。

总之，随着RNA干扰机制研究的深入和完善，应用RNA干扰技术，必将大力推动人类疾病的治疗和人类功能基因组学的发展。

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