麻疹病毒细胞受体研究进展

苏建青，褚秀玲，马秀亮，江 成，张吉清

（聊城大学农学院，山东 聊城 252000）

麻疹病毒（Measles virus，MV）属于副黏病毒科、麻疹病毒属，是一种有囊膜、不分节段的单链负义RNA病毒[1]。同属的病毒还包括牛瘟病毒（Rinderpest virus，RPV）、犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）、小反刍兽疫病毒（Peste－des－petits－ruminants virus，PPRV）和海豹瘟热病毒 （Phocine distemper virus，PDV）等[2]。MV 有两种囊膜糖蛋白，即血凝素蛋白H（hemagglutinin，H）和融合蛋白F（fusion protein，F），它们分别参与病毒和细胞的连接和融合[3]。

MV通过气雾进入呼吸道引发感染，病毒首先在呼吸道复制，侵入扁桃体等上呼吸道的淋巴细胞，扩增后随淋巴液和血液扩散到全身，导致全身性的淋巴器官感染，包括胸腺、脾脏、淋巴结、骨髓、黏膜相关淋巴组织、胃肠道黏膜固有层巨噬细胞和肝脏枯否氏细胞[4]。在感染数天之后发生 二次病毒血症，最终导致全身各实质器官和组织细胞的感染，包括呼吸系统、消化系统、泌尿系统、内分泌系统、淋巴组织、中枢神经系统和脉管系统的细胞，如角蛋白细胞、成纤维细胞、血细胞、各种淋巴样细胞及支气管上皮细胞和内皮细胞[5]。在细胞水平上，MV通过与细胞膜融合进入细胞。H蛋白首先连接到细胞受体上，在辅助蛋白F的伴随下诱导复合物构象改变，随后，F蛋白内部的疏水性融合肽暴露，并插入到靶细胞的质膜中，从而拉近病毒囊膜与靶细胞质膜的距离，最终导致膜融合[6]。

MV在1954年首次通过原代人肾细胞分离，命名为Edmonston株，是目前弱毒疫苗的祖先株[7]。来源于非洲绿猴肾细胞的Vero细胞通常被用于分离临床样品中的MV，但是Vero细胞的分离率非常低[8]。随后，Kobune F等[9]偶然发现 EB病毒转化的绒猴B淋巴细胞系B95a对临床样品中的MV高度敏感，但是因为B95a细胞能够少量释放具有致瘤作用的EB病毒，使其使用受到限制。细胞受体是公认的引发病毒感染宿主细胞的主要决定因素，也是影响病毒宿主特异性和组织亲嗜性的决定因素。本文对已经发现的MV的3个受体——膜辅蛋白CD46、信号淋巴细胞激活因子SLAM和黏附分子Nectin－4进行综述。

1 膜辅蛋白CD46

人膜辅蛋白 MCP（human membrane cofactor protein，MCP）是在 MV Edmonston株发现的第1个细胞受体。膜辅蛋白是由Cole J L等[10]应用C3b亲和层析在外周血淋巴细胞上发现的一种膜蛋白，对Ⅰ因子介导的补体C3b和C4b的裂解有辅助活性，命名为MCP。第四届国际白细胞分型讨论会上认为它是补体系统的一种新的调节蛋白，命名为CD46。MCP为Ⅰ型单次穿膜糖蛋白，属于补体激活调节因子（RCA）基因簇的成员。MCP存在于所有的有核细胞上，但不同类型的细胞上表达的数量有所不同。MCP的主要功能是其辅因子活性，即可与C3b或C4b结合而促进Ⅰ因子对C3b和C4b的裂解灭活，从而保护自身宿主细胞免遭补体介导的溶解破环[11]。人MCP的基因定位于第1号染色体长臂3.2区，基因长度至少为43ku。MCP通过mRNAs剪切至少产生6种同系物，编码两组分子质量51ku～58ku和59ku～68ku的蛋白。在多肽链的前250个氨基酸中，胞外区含有4个相邻的短共有重复区（SCRs）。SCR后为一段富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基的STP区，再后依次为13个氨基酸的功能不明区、24个氨基酸的跨膜区、105个氨基酸的胞浆锚和23个氨基酸构成的胞浆尾部[12]。CD46的 MV结合区位于SCRs1和2，针对CD46SCRs1－2的单抗可抑制 MV感染。SCR1缺失的CD46突变体不能与MV结合[13]。

CD46表达在人除了红细胞以外的所有有核细胞上。因此，MV的Edmonston株能在大多数的灵长目细胞上生长。但猴的红细胞也表达CD46，所以有血凝活性。在1993年，两个实验室分别用不同的方法证明了CD46是MV Edmonston株的受体。Dörig R E等[14]通过遗传学的方法证明了CD46是MV Edmonston株的受体。MV能够连接到非洲绿猴红细胞上，并使其发生凝集。因此，当MV存在时，非洲绿猴红细胞和MV易感的宿主细胞能够形成花环结构。Dörig R E等利用MV这种特性检测了许多鼠人杂交细胞系，发现含有人完整1号染色体的杂交细胞株能够不同程度的形成花环，说明MV感染细胞的受体基因位于人1号染色体上。试验中还发现两种突变的杂交细胞系对MV的感染差异，进一步将受体基因位置定位到人染色体1p31附近或1p臂上。在这一区域的淋巴细胞表面标志基因主要包括CD2、CD48、Fc受体、CD16、L选择素、CD35、CD46和CD55等。先前已经有实验室发现一株能阻止MV感染的单抗。这个抗体能够识别来源于Hela、Vero等细胞的两种分子大小为57ku和67ku多肽。符合这种分子质量大小，且位于人1号染色体上的表面标志膜蛋白基因仅有膜辅助蛋白CD46基因。因此，推测CD46是MV的受体。用针对人CD46的单抗和多抗可以阻止MV对HeLa细胞系的感染。将人CD46的真核表达载体转染到MV的非易感细胞仓鼠卵巢细胞（CHO）中，可以使CHO细胞变得对MV易感，进一步证明CD46是MV的受体。

Naniche D等[15]也证明了MV的受体是CD46，获得一株能阻断表达MV H和F蛋白的重组牛痘病毒感染人的细胞的单抗，命名为 MCI20.6。MCI20.6能识别人和猿细胞上分子大小为57ku和67ku蛋白（gp57／67）。通过免疫亲和层析使用MCI20.6从Jurkat细胞中纯化出gp57／67，通过对N末端的前15个氨基酸测序，序列比对显示gp57／67和人CD46相近。因此，推测CD46是MV的受体。通过I125标记的HeLa细胞和MCI20.6和抗CD46抗体GB24共沉淀进一步证实MCI20.6识别CD46抗原。将人CD46的真核表达载体转染到MV的非易感细胞鼠B细胞中，可以使鼠B细胞变得对MV易感，进一步证明CD46是MV的受体。

仅MV的疫苗株和实验室适应株使用CD46作为感染受体。在Vero细胞生长适应的MV是体外适应的结果，氨基酸推导也证实了经Vero细胞适应后H蛋白存在氨基酸替换的现象[16]。CD46也不是CDV和RPV的受体，但细胞培养适应株CDV和RPV能有效感染Vero细胞。CD46也可以作为其他的病毒或细菌作为受体，如腺病毒，A群溶血性链球菌，某些奈瑟菌株和人类疱疹病毒6型也以CD46作为细胞受体。

2 信号淋巴细胞激活因子

信号淋巴细胞激活因子（signalling lymphocyte activation molecule，SLAM／CD150）是Tatsuo H 等2000年[17]发现的MV的第2个细胞受体。SLAM（也称为cD150，CDw150）是表达在未成熟的胸腺细胞、激活的T，B淋巴细胞、巨噬细胞、造血干细胞和成熟的树突状细胞表面上的糖蛋白。SLAM是Ⅰ型膜蛋白，分子质量为70ku，属于免疫球蛋白超家族CD2成员。SLAM结构与CD2家族的其他成员一样，SLAM在分子结构上包括2个高度糖基化的免疫球蛋白超家族结构域，1个多变的V结构域和1个稳定的C2结构域（含2个二硫键），随后是跨膜区和胞浆区，胞内区包含有免疫受体酪氨酸转换序列（ITSM）和非ITSM磷酸化酪氨酸残基，ITSM基本结构为TV／IYxxV／I基序（x为任意氨基酸），可通过结合SAP或其他含有SH2结构域的分子调节下游信号[18]。SLAM的主要功能是促进T、B淋巴细胞或抗原递呈细胞相互作用。SLAM活化可导致免疫反应Th1－Th2平衡向Th1型转变，促进Th1型细胞因子的产生，通过上调IFN－γ和下调IL－4，最终导致T细胞依赖性的体液免疫功能缺乏[19]。

已知Edmonston株能利用CD46分子作为其受体，而大部分临床使用EB病毒转化的绒猴B淋巴细胞——B95a或B95－8分离的MV株，仅感染某些灵长类T、B淋巴细胞，并不能利用CD46受体，表明淋巴细胞表面的某种受体参与了MV入侵细胞的过程。Tatsuo H 等[17]使用携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的重组水疱性口炎病毒假型系统（VSVDG＊）证明了麻疹病毒的第2个受体。重组VSVDG＊利用GFP代替VSV自身的囊膜糖蛋白G，失去了感染细胞的能力，可通过表达外源膜蛋白感染宿主细胞，通过观察GFP表达来确定外源膜蛋白感染细胞的能力。用真核表达载体pCAGGS构建了B95a细胞系的cDNA文库。从每组文库中提取质粒DNA并转染对Edmonston株敏感而对B95a分离株不敏感的人肾细胞系293T，然后用表达KA株（B95a分离株）的血凝蛋白H和Edmonston株（Vero分离株）的融合蛋白F的假型病毒（VSVDG＊－KAHF）感染。在对B95a细胞系的cDNA文库试验中，其中一组文库比其他文库观察到了更多的荧光。对这个文库中的克隆继续细分，直到缩小到文库中的单一克隆。对这个克隆进行DNA测序，序列分析表明该猿猴B淋巴细胞cDNA克隆的编码区与人SLAM在核苷酸水平上同源性高达91%，提示SLAM可能是MV的受体。为探明表达SLAM 的细胞能否与MV结合，用表达人SLAM的真核质粒（pCAGSLAM）或CD46的真核质粒（pCAGCD46）瞬时转染对MV不敏感的中国仓鼠卵巢细胞（CHO），再用MV感染，结果发现KA株与表达SLAM的CHO细胞高水平结合，与表达CD46的CHO细胞低水平结合，Edmonston株与两者均结合良好。一种针对人SLAM的特异性单抗IPO－3能够阻断KA株和Edmonston株感染CHO或B95a细胞所产生的CPE。上述结果表明，SLAM分子可支持MV对非MV敏感细胞的结合、入侵、胞内复制和CPE发生，且感染可被抗SLAM抗体所阻断，表明SLAM为MV的细胞受体。

MV的野毒株、疫苗株和Edmonston株都可利用SLAM受体。Tatsuo H等[20]证实CDV和RPV分别以犬和牛的SLAM作为受体。进一步研究发现，大多数MV、CDV和RPV可以人、犬和牛任意的SLAM为受体，因此，可知SIAM是麻疹病毒属的受体。麻疹病毒等以SLAM作为感染的细胞受体，SLAM分子在人、牛和犬等不同种属哺乳动物之间具有较高的同源性，很好的解释了病毒在体内组织的定位及其感染的淋巴细胞嗜性和造成感染宿主的机体免抑制等病理现象[21]，但很难解释病毒在感染宿主体内肺脏、肝脏、胃肠道等非表达SLAM的组织细胞中大量分布的现象。

3 黏附连接蛋白Nectin－4

黏附连接蛋白 Nectin－4是 Noyce R S等[22]在2011年发现的MV的第3个细胞受体。Nectin－4又名脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白（poliovirus receptor－like protein 4，PVRL4），脊髓灰质炎病毒相关受体（poliovirus receptor－related，PRR4）。Nectin－4属于免疫球蛋白超家族（IgSF）的细胞黏附分子，是一种非钙依赖性的细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAM ）。Nectin－4属于Ⅰ型单次跨膜蛋白，由510个氨基酸组成，预期分子质量是55.5 ku。Nectin－4蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区由一个可变区和两个稳定区构成，分别是Ig－V，两个Ig－C2，随后是跨膜区，胞内区包含一段较为保守的序列（Glu／Ala－X－Tyr－Val），被称为PDZ结合motif。通过它与丝状肌动蛋白结合蛋白afadin上的PDZ结构域结合，从而与细胞骨架相连[23]。Nectin－4是一种胚胎期蛋白，主要表达在胎儿时期各组织、器官及成人胎盘中。研究显示，Nectin－4大量表达在肺、乳腺、结肠和卵巢腺癌细胞上的一种蛋白质，被认为是一种新的肿瘤细胞标志物[24]。The Human Protein Atlas Project （www.proteinatlas.org）报告了PVRL4在人胎盘滋养层，胃腺细胞，肺、乳腺和卵巢腺癌细胞大量表达，在扁桃体、口腔黏膜、食道、鼻咽和气管的柱状上皮细胞上中等数量表达，在肺巨噬细胞和大脑皮层的神经细胞上少量表达。

临床解剖和病理变化发现，野型MV能感染气管、支气管、肺、口腔、咽、食道、小肠、肝和膀胱上皮细胞，并能向外排毒[25]。还发现，原代培养的人小气道上皮细胞（SAEC）在无血清的培养液中生长对wtMV不易感，但是在培养液中加入20mL／L胎牛血清，SAEC就变得对wtMV易感了[26]。这些细胞不表达SLAM，wtMV不适用CD46，提示有另一个受体在上皮细胞上。临床中也观察到麻疹病毒可以感染来源于肺、乳房和结肠等器官腺泡上皮细胞的腺癌（adenocarcinomas）细胞，故在临床上作为“溶瘤病毒”用于癌症的治疗[27]。最近，一种间质上皮细胞在转录阻抑物SNAIL作用后失去了紧密连接蛋白，变得对wtMV感染不敏感了，提示紧密连接蛋白可能是作为病毒进入上皮细胞的因子[28]。

为了寻找存在于上皮细胞中的受体，Noyce R S等[22]使用 Affymetrix Human Gene ST 1.0 基因芯片对 wtMV 的易感细胞 （MCF7、MDA－MB－468、T47D、NCI－H358、MGH24、NCI－H125）和非易感细胞（MDA－MB－231、A549）的膜蛋白黏附分子 mRNA进行比较分析。提取乳腺癌细胞（MCF7、MDAMB－468、T47D、MDA－MB－231），肺腺癌细胞（NCIH358、MGH24、NCI－H125、A549），SAEC（血清和非血清处理）细胞的mRNA，分析其紧密连接蛋白和黏附连接蛋白的表达量变化，发现许多膜蛋白表达量发生了上调。通过对上调幅度大于20%的蛋白进行分析。首先，分析乳腺癌和肺腺癌共同上调的48个基因。将这些基因分别构建真核表达载体，转染到对wtMV不敏感的猴肾细胞系COS－1中，用带绿色荧光蛋白基因的wtMV感染，结果均没有成功。随后，选取胸腺癌、肺癌和活化的SAEC三类共同上调的11个基因进行真核载体的构建和感染试验，结果发现人PVRL4（Nectin 4）基因，可以使非易感细胞COS－1获得 wtMV感染的能力，说明PVRL4可能是MV的上皮细胞受体。随后，作者又对非易感细胞（OMK、HeLa、A549和 MDA－MB－231）进行Nectin－4瞬时转染和感染试验，证明wt－MV可以利用Nectin 4感染这些非易感细胞。针对Nectin－4基因的siRNA封闭试验、抗体封闭试验也进一步证明了PVRL4（Nectin－4）是wtMV感染上皮细胞的受体。

Michael D等[29]也同时证实了Nectin－4是 MV的受体，并首先使用Gene Expression Omnibus（GEO）microarray data GSE8332分析了来源于呼吸道上皮细胞的MV易感细胞（H358和 H441）和非易感细胞（H23和H522）的膜蛋白基因，发现了175个差异膜蛋白基因。根据基因表达量和生物学特征选取了其中的22个基因，构建真核表达质粒，转染MV非易感细胞CHO，检测其作为MV受体的可能性，结果全部是阴性。随后，将选择范围扩大到7个来源于呼吸道和膀胱的上皮细胞，通过基因芯片分析其mRNA，发现了222个表面相关蛋白基因，选取了其中的16个进行检测，结果发现Nectin－4能使MV感染表达它的CHO细胞。说明Nectin－4能够被MV利用感染细胞。通过体外呼吸道模型感染实验证实MV感染呼吸道上皮细胞必须依赖于Nectin－4受体，针对Nectin－4的siRNA能够阻断MV的感染，不能够识别Nectin－4的MV将不能通过呼吸道排毒。Nectin－4受体表达在上皮细胞的结合点之间和上皮细胞的顶侧和基底侧。MV可以通过Nectin－4从呼吸道上皮细胞的基底侧感染，并通过细胞侧面进行传播。已经证实肝炎病毒C、呼肠病毒、单纯胞疹病毒和柯萨奇病毒都使用连接蛋白作为感染受体。如这个家族的原型成员PVR（CD155）是脊髓灰质炎病毒的受体，PVRL1（Nectin 1）是单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的主要受体。

一直以来副黏病毒对上皮细胞感染的受体机制没有被阐明。MV对上皮细胞感染受体的证实，有利于解释MV体内的感染途径和致病机理。同属的CDV病毒在临床病例中也被发现上皮细胞感染的现象，如在自然感染的犬出现脚垫角质化不全或过度角化。通过对感染犬全身组织病毒含量的检测发现，在气管、膀胱、皮肤等上皮细胞中均显示病毒阳性[30]。Nectin－4是否也象SLAM受体一样，也被本属的其他病毒利用，有待于进一步证实。

受体在病毒感染细胞过程中起很重要的作用。了解和研究病毒受体有助于明确病毒感染的宿主范围、组织和细胞嗜性，从分子水平上阐明病毒的吸附机制及在体内的播散方式，也为设计受体模拟分子和新型的多肽疫苗提供理论依据，对于控制麻疹病毒的感染和传播具有特别重要的意义。

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