电针的不同波形对实验性大鼠急性痛风性关节炎滑膜组织中HSP70表达的影响

金 弘，刘婷婷，陈英华，刘 勇，孙晓伟

(1．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040;2．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040)

痛风是由尿酸钠结晶(MSUC)沉积在关节周围而引起的一种炎症，临床以关节剧痛伴肿胀发热暗红为主要表现的急性痛风性关节炎是痛风最常见的首发症状，亦是痛风的最基本的类型，典型发作一般多起病急骤，有时呈爆发性，多于午夜足痛惊醒，其疼痛性质为刀割、咬噬样，关节及周围组织红、肿、热、痛，是由于体内的嘌呤代谢紊乱所致的尿酸升高或排泄减少致尿酸钠或尿酸结晶从超饱和的细胞外液沉积于组织所致的急性炎症反应［1～3］。为此，本研究以急性痛风性关节炎大鼠为研究对象，对比观察电针的不同波形对实验性大鼠急性痛风性关节炎滑膜组织中HSP70表达的影响，以筛选出临床疗效更佳的电针治疗方法。

1 材料与方法

1．1 实验动物分组及处理

清洁级雄性Wistar大鼠120只，体重(255±20)g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供(合格证号:黑动字第P00102005)。常规饲养1周后，将120只Wistar大鼠随机分为5组，即空白组、模型组、电针疏波组、电针疏密波组、电针密波组，每组24只。

1．2 尿酸钠溶液的制备

1 250 mg尿酸钠晶体加45 ml生理盐水，再加5 ml吐温－80(失水山梨醇脂肪酸酯聚氧乙烯醚－80)，加热搅拌，配成50 ml尿酸钠溶液。

1．3 造模方法

模型制作按Coderre等经典方法略作改进，即用6号注射针从受试大鼠右后肢踝关节背侧，以45°方向插入胫骨肌腱内侧，将0.2 ml尿酸钠溶液注入到踝关节腔，复制急性痛风性关节炎模型。

1．4 针刺方法

各组动物分为1天、3天、5天3个时间点，每个时间点观察8只，分别于实验第1天造模，造模3 h后开始进行干预。

针具:0．25 mm×13 mm华佗牌无菌针灸针。取穴:病变侧足三里、三阴交，穴位选取依据《实验针灸学》的动物穴位图谱，并以比较解剖和骨度分寸法为依据模拟定位［4］。

针刺方法:空白组:不造模，不治疗;模型组:造模3 h后开始，每天与其它治疗组动物同样方法固定1次，每次20 min，连续5天;电针疏波组:将大鼠固定在特制的鼠架上，直刺“足三里”、“三阴交”，使其针感传导，令“足三里”、“三阴交”构成回路，然后连接SDZII型电针仪，正极在上，负极在下，选用疏波刺激，频率为2 Hz，电压为2 V，强度以见大鼠下肢肌肉收缩引起肢体轻微颤动为宜，每天1次，留针20 min，连续5天;电针密波组:同电针疏波组，但选用密波刺激，频率为100 Hz，电压为2 V，强度以见大鼠下肢肌肉收缩引起肢体轻微颤动为宜，每天1次，留针20 min，连续5天;电针疏密波组:同电针疏波组，频率为2 Hz/100 Hz，电压为2 V，强度以见大鼠下肢肌肉收缩引起肢体轻微颤动为宜，每年1次，留针20 min，连续5天。

1．5 采用PV免疫组化两步法检测滑膜细胞HSP70表达

①切片常规脱蜡到水;②3%H2O2中孵育10 min，PBS冲洗2 min 3次;③微波修复:切片入枸椽酸盐缓冲液(PH6)，微波炉中5 min 2次，中间间隔10 min。自然冷却至室温;④滴加一抗，4℃冰箱中过夜，PBS冲洗2 min 3次;⑤滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗2 min 3次;⑥DAB显色5～10 min，蒸馏水充分冲洗;⑦苏木素复染1 min;⑧常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1．6 数据统计方法

所有数据均采用SPSS13．0统计软件进行分析。计量资料用One－Way ANOAY方差分析，组间比较选用LSD及S－N－K分析。文中数据用均数±标准差(±s)表示。

2 结果

MSUC混悬液注射后，模型组与空白组比较HSP70表达增强，经过治疗，电针各组HSP70蛋白表达进一步升高，与模型组比较有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，说明电针各组均能上调急性痛风性关节炎大鼠HSP70含量。治疗各时间点，电针疏波组与电针密波组比较无统计学意义(P＞0.05);电针治疗第3、5天，电针疏密波组与电针疏波组及电针密波组比较有统计学意义(P＜0.05)。提示电针疏密波组对上调急性痛风性关节炎大鼠HSP70蛋白含量的作用优于电针疏波组及电针密波组。详见表1。

表1 各组大鼠踝关节滑膜组织中HSP70表达的变化(平均灰度值，±s)

表1 各组大鼠踝关节滑膜组织中HSP70表达的变化(平均灰度值，±s)

注:与空白组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较，☆P＜0.05;☆☆P＜0.01;与电针疏波组比较，▲P＜0.05;与电针密波组比较，★P＜0.05。

组别 动物(只) 1天 3天 5天147．63 ±29．55 148．14 ±28．36 148．5 ±31．04模型组 8 157．00 ±25．12* 159．75 ±27．85* 163．5 ±29．88＊＊电针疏波组 8 161．25±26．47＊＊☆ 163．88±29．23＊＊☆ 169．88±32．94＊＊☆电针密波组 8 163．13±28．15＊＊☆ 164．88±33．64＊＊☆ 170．13±34．27＊＊☆电针疏密波组 8 163．15±28．97＊＊☆ 172．25±32．82＊＊☆▲★ 181．75±35．38空白组8＊＊☆☆▲★

3 讨论

痛风性关节炎是尿酸钠盐结晶引起的炎症反应。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)又称“应激蛋白”，是生物体在不利因素下诱导基因开放而合成的一组新蛋白质，对维持细胞的正常状态及功能有重要作用。HSP还是一种强烈的免疫原性分子，具有调节自身免疫过程的能力［5］。现在普遍认为HSP70这种广泛存在、进化上高度保守的“分子伴侣”是细胞保护的物质基础，其在应激状态下，可以增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，提高细胞生存率［6］，保护细胞生命活动及蛋白质以维持细胞生命;参与免疫调节，能保护细胞对抗TNF和内毒素的损伤，还可引起宿主的抗感染免疫;在炎症反应中，具有保护组织避免受活性氧因子诱导的DNA链断裂，类脂过氧化和保护线粒体结构，因此在炎症免疫性疾病中，HSP70在免疫方面发挥着重要的功能。

本实验研究发现，正常大鼠踝关节局部组织仅见少量的HSP70蛋白表达，而急性痛风性关节炎大鼠HSP70蛋白表达增高，这可能与炎症细胞因子的刺激有关，是机体产生的一种自我保护反应。电针可促进急性痛风性关节炎大鼠局部组织大量表达HSP70蛋白，提示电针作为一种生理性适宜刺激(瞬间高温)诱导体内具有细胞保护作用的HSP70大量合成，可能是其治疗急性痛风性关节炎的重要作用途径之一。

上述结果可以看出电针各组均有上调HSP70蛋白表达的作用，电针疏波组和电针密波组作用相似，而电针疏密波组优于电针疏波组和电针密波组。它为探讨针灸效应的机理研究提供了新的重要线索，毫无疑问，电针诱导HSPs的合成，从而对机体产生保护作用，可能是针灸效应的重要机制之一，有必要在此领域进行深入系统的研究。

电针疗法是传统针刺与现代电针仪相结合应用的一种疗法，电针可起到补肾益精、舒筋通络、消肿止痛的作用，其治疗作用具有多层面、多途径、多靶点的作用特点，经过中枢的整合后可有效的调控信号转导通路来调节机体的免疫应答以及细胞的增殖、分化及凋亡，从而能有效减轻患者的临床症状［7］。临床研究中发现，电针疏通经络气血运行，从整体上双向调节细胞免疫和体液免疫，有效地治疗痛风性关节炎。实验针灸学亦证实电针能广泛地激活神经、内分泌系统，调节实验动物免疫功能，达到止痛、消肿、改善关节功能的目的。其次，电针仪制造技术成熟、各项参数稳定，可保障实验过程中条件的统一性和可重复性，使实验数据更客观、准确。本实验中选用的华佗牌SDZ－II电针仪因其性能稳定和良好的治疗作用，在针刺研究中已被众多研究者所采用。

电针治疗本病取足三里、三阴交二穴相配，一阴一阳，可以鼓舞正气、补益气血、健脾和胃、祛湿化痰，从而使气血运行畅通，湿热之邪随之排出体外。以上二穴合用，能够激发经气，活血通络，祛邪外出，共奏标本同治之功。通过以上试验，电针足三里、三阴交穴后，对实验动物起到消肿止痛、扶正祛邪的治疗作用。从细胞和分子水平使失衡的免疫系统及神经内分泌网络趋于稳定。电针具有很好的抗炎止痛效果，使用电针增强腧穴刺激，通过神经传导提高机体痛阈，从而发挥镇痛效应，减少了症状“反跳”的发生。总之，电针对急性痛风性关节炎有很好的疗效，具有疗效好、不良反应少的优点，为临床中西医结合综合疗法治疗急性痛风性关节炎提供了一种新方法，值得推广。

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