食品微生物检测技术研究进展

王秀芹，张 敏，颜 萍

(1.朝阳师范高等专科学校，辽宁 朝阳 122000;2.北京汇源饮料食品集团有限公司检测中心，北京 101305;3.山东省胶州市质量技术监督局，山东胶州 266300)

随着科学技术的不断提高，人民生活水平的日益增长，食品的安全问题越来越成为人们关注的焦点，食品中暴露出的问题也越来越多，人们对于食品的安全则有了更高的要求。国家对于食品卫生的检测力度也逐渐增强，食品微生物检验是评价食品卫生质量、保证食品安全、预防和控制食源性疾病的重要手段之一。因此，食品中关于微生物检测方法和技术的探讨也显得尤为重要。

1 分子生物学方法

1.1 PCR 检测

PCR(Polymerase Chain Reaction)聚合酶链反应，是由Kary Mullis等人首创的一项体外快速扩增DNA的方法，它可使极微量的某一特定序列的DNA片断在数小时内特异性扩增至百万倍以上［1］。PCR 反应是将模板 DNA、引物、Taq酶、dNTPs、镁离子、缓冲液、双蒸水等混合物装在PCR微型管中，在可编程调控的PCR仪上完成。

PCR技术具有简易、快速、灵敏和高特异性的优点，可以扩增待检微生物目的DNA很快判断某种微生物是否存在。PCR技术还可以检测那些人工无法培养或难以培养的微生物，从而大大增加诊断检查内容和诊断能力。目前，已经有了自动化PCR检测试剂盒仪器，使用比较方便，但仍然需要增加一些专用的设备。PCR技术可以对特定的致病菌进行检测，已经成功地对沙门氏菌［2］、大肠埃希菌 O157∶H7［3］、产单核细胞李斯特菌［4］等致病菌进行了有效测定。PCR技术也存在着假阳性问题、假阴性问题以及定量困难的问题，所以还不能成为一种常规检测方法。

1.2 核酸探针技术

核酸探针技术是用同位素或其他的标记方法对已知核苷酸序列DNA片段进行标记，将其加入到已变异的DNA样品。这样在一定的条件下就能和这种样品的同源序列的DNA区段形成杂交双联，达到鉴定DNA的目的。核酸探针检测技术具有特异性、敏感性的优点，但也存在一些问题，如一种菌需要制备一种探针;对样品进行一段时间的培养才能达到检测量;对毒素污染的不含产毒菌的食品无法检测［5］。

2 代谢学技术

2.1 电阻抗技术

电阻抗技术是近年来发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于微生物的检测。它是指细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大部分电惰性物质，代谢为具有电活性的小分子物质，其能增加培养基的导电性，使阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化来判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该方法已用于食品中细菌总数、大肠埃希菌、沙门氏菌等［6］微生物的检测，且具有高敏感性、特异性、快速反应性和高度重复性等优点。

2.2 微热量计技术

微热量计技术是通过细菌生长时热量的变化对细菌进行检出和鉴别。微生物在生长过程中产生热量，用微热量计测量产热量等数据，存储于计算机中，经过适当信号上的数字模拟界面，在记录器上绘制成以产热量对比时间组成的热曲线图，与已知细菌热曲线图比较，即可对细菌进行鉴别。目前，应用该技术研究细菌的抑制作用［7］。

2.3 放射测量技术

放射测量技术(RM)是物理与化学诊断一体的新型检测技术，主要用于培养基中微生物的检验。根据细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物产生CO2的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物或盐类等底物分子中进行检测的技术［8］。细菌生长时，这些底物被利用并释放出含放射性的14CO2，然后自动化放射测定仪Bactec测量14CO2的含量，来判断细菌的数量。本方法具有快速、准确度高和自动化等优点。放射测量技术已经被应用于大肠埃希菌的定量检测。

3 免疫分析检测

3.1 免疫荧光技术

免疫荧光技术(immunofluorescence Technique)就是用荧光素标记的抗体检测抗原或抗体的免疫学标记技术又称荧光抗体技术。所用的荧光素标记抗体通称为荧光抗体。实际应用上主要有直接法和间接法。直接荧光抗体检测法是在检样上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知细菌特异性抗血清，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的抗体后在荧光显微镜下观察结果。可用来对沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E.coli O157和单核细胞增生李斯特氏菌等进行快速检测。王军等［9］建立了养殖大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体免疫快速检测技术。该技术的主要特点是特异性强、敏感性高、速度快。但是还存在一定的不足，如非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序比较复杂。

3.2 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术 ELISA技术(enzyme，linked fluorescent immunoassay)，全称荧光酶标免疫分析，最早出现于19世纪70年代，它是在酶联免疫吸附分析的基础上发展起来的一种快速、先进的现代食品微生物分析检测方法，最近几年出现了更灵敏的显色剂和底物，提高了ELISA的有效性。ELISA技术是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。它结合了免疫荧光法和放射免疫测定法2种技术的优点，具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、适用范围宽、结果判断客观、简便完全、检测速度快以及费用低等特点，可同时进行上千份样品的分析。近年来，ELISA技术已经逐步应用与食品中大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等方面的检测分析［10］。

酶联荧光免疫分析技术是将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物，可提高分析的灵敏度和增宽测量范围，减少试剂的用量。酶放大技术、同相分离及荧光检测三者的联合将成为荧光免疫分析中最灵敏的方法。

4 分析化学技术

分析化学技术的不断更新，使仪器分析手段和方法在微生物检测方面取得了一定的地位。如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LCMS/MS)等。这些方法不同于依赖微生物生物学特征的检测方法，而是通过分析微生物的化学组成(生物标志物)来区分和鉴定微生物，开辟了检测和鉴定微生物的新途径。例如:气相色谱分析是利用微生物细胞分离的方法研究微生物分类的。其原理是将微生物细胞经过水解、甲醇分解、提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析。得到特征峰来进行微生物鉴定。大量分析检测各种常见细菌、酵母菌、霉菌和其他微生物的组成成分，并建立微生物组分标准色谱图文库，然后将待鉴定微生物的组分色谱图与标准图谱相比较，迅速鉴定其种类［11］。

5 展望

伴随着微生物检测技术的不断发展进步，检测的方法也越来越多样化，除了上述介绍的几种方法以外还包括基因芯片检测、流式细胞术、免疫磁性微球等检测方法。每一种检测方法都有其自己的优点和缺点，在检测时要根据自己的实际情况选择适合的方法，还可以适当的选择几种方法结合起来使用，以提高检测的准确性。

目前食品安全是一个重大的世界性公共卫生问题，不仅影响到人类的健康，而且关系到国家的稳定。虽然病菌不断的进化，但是检测方法也在不断的改进，相信在不久的将来会研发出更加简单快速的病原微生物检测方法和检测体系，为社会的饮食安全把好关，这也必将为人类的公共卫生、营养健康、饮食习惯与疾病预防事业做出巨大的贡献。今后食品微生物检验技术将会向高效率、高标准、高精准度、高灵敏度的方向发展。

［1］迪芬巴赫C W著，黄培堂译.PCR技术实验指南［M］.北京:科学出版社，2000.

［2］刘光明，徐庆研，龙敏南，等.应用PCR-ELISA技术检测转基因产品的研究［J］.食品科学，2003，24(1):101-105.

［3］Heron E.Applied biosystem:innovative technology for the life sciences［J］.Amer lab，2000，2(24):35-38.

［4］Walser P E.Using conventional micro titer plate technology for the automation of microbiology testing of drinking wate［J］.J Rapid Methods Automat Microbial，2000，8(3):193-208.

［5］徐茂军.基因探针技术及其在食品卫生检测中的应用［J］.食品与发酵工业，2000，27(2):66-70.

［6］陈广全，张惠嫒，饶红，等.电阻抗法检测食品中沙门氏菌［J］.食品科学，2001，22(9):66-70.

［7］刘永军，南昭东，孙海涛，等.限制性条件下药物对细菌抑制作用微量量热法研究［J］.生物工程学报，1996，12(1):60-64.

［8］林蕾，张炜.食品微生物检验技术的研究进展［J］.现代农业科学，2008，15(10):97-99.

［9］王军，鄢庆枇，苏永全，等.溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测［J］.海洋科学，2002，26(7):1-4.

［10］寇运同，张明玉，韩青，等.荧光酶标分析系统快速检测食品中的沙门氏菌［D］.中国动物栓疫，2000，17(9):39-40.

［11］Wilson WJ，Strout CL，Desantis TZ，et al.Sequence-specificidentication of 18 pathogenc microorganisms using microarray technology［J］.Mol Cell Probes，2002，16(2):119-127.