肠三叶因子对肠黏膜保护与修复的研究

章美元 综述 韩 真* 审校

皖南医学院附属弋矶山医院消化内科（241001）

三叶因子家族是近年研究较多的一群小分子多肽，具有黏膜保护、修复、抑制炎症介质反应、调节细胞免疫和细胞凋亡等功能。目前已发现3种三叶肽，即乳癌相关肽（pS2/TFF1）、解痉多肽（SP/TFF2）和肠三叶因子（ITF/TFF3）。 其中ITF于1991年由Suemori等[1]首次在大鼠空肠发现，其既是肠道特异性黏膜修复因子，又是黏膜损伤的快速反应肽。本文就ITF对肠黏膜保护与修复的研究作一综述。

一、ITF的结构特点和性质

ITF主要是由杯状细胞分泌的特异分布于肠黏膜表面的多肽物质。人ITF编码基因定位于21号染色体长臂（21q22.3）长度为55 kb的片段中，并可连锁表达[2]。ITF为含有59个氨基酸的单链多肽，分子质量为6～7 kDa（1 Da=0.9921 u），同源序列约有38～39个氨基酸，包括保守和半保守的氨基酸。保守氨基酸中包含6个半胱氨酸残基，形成三个链内二硫键，交联方式为1-5、2-4、3-6，从而产生特征性三叶结构。ITF的结构保守，具有抗酸、抗蛋白酶和抗热分解等特性。

ITF分布有较强的组织特异性和细胞特异性[3]。ITF主要在小肠、结肠和胃窦黏膜[4]中高表达，各段小肠中ITF含量差异不明显[5]。近来研究发现人食管黏膜下腺体（主要在Z线和胃贲门之间）可见ITF较高表达，在胰腺、唾液腺、泪腺、鼻黏膜、前列腺、子宫、乳腺、气管、肺、下丘脑、垂体、海马回[6]等组织中亦有低水平表达，此外ITF亦可在乳汁中表达，胎儿出生前后ITF表达不同[7,8]。

在病理状态下，ITF表达发生明显改变，分布缺乏组织专一性，在食管肠化生、胃食管反流病、胃溃疡、肠道慢性炎症以及腺瘤、腺癌等中均有表达。Kadri等[9]发现ITF在Barrett食管（BE）而非邻近组织中高表达，有望成为BE非内镜检查的标记物。ITF表达与结肠肿瘤预后相关，其表达增高提示预后不良[10]。ITF在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和肝癌组织中亦有表达。Vestergaard等[11]报道前列腺癌患者血浆ITF浓度增加，但其是否可作为预测前列腺癌的指标，仍需进一步研究证实。ITF在肝细胞癌组织中高表达，并与肝细胞癌分级有关[12]。ITF在肿瘤中的高表达与其功能密切相关，同时进一步证明TFF的生理作用是一个复杂的调控过程。

二、ITF的黏膜保护机制

1.与黏蛋白的结合：整个胃肠道不断受到各种理化、生物因素的侵袭，需一套有效的机制来维护黏膜完整性并及时修复损伤的黏膜。ITF和黏蛋白由相同的杯状细胞产生，损伤发生时两者的表达同时上调。研究发现ITF与黏蛋白结合时保护作用增强[13]。ITF分子的空间结构中有一大小为0.8～1 pm的间隙能特异性地与黏蛋白的侧链结合，对黏蛋白的分子结构起支架作用，且其结合位点可随黏蛋白的侧链不同而进行调整。两者结合后，形成凝胶复合物，起稳定黏液层的作用，能阻止多种蛋白酶以及机械应力等因素造成的肠黏膜损伤。此外，两者之间还存在互相作用的机制，如黏蛋白可使肠上皮细胞表面ITF结合蛋白表达上调从而促进ITF与肠上皮细胞的结合[14]。ITF可通过二硫键与黏蛋白相互交联，形成黏弹性的黏液凝胶层，且在应用ITF后明显增加可溶性黏液的分泌量并增加其黏度。实验[15]证实ITF具有保护黏膜的作用，其对黏膜保护作用的机制为稳定黏液层以及刺激上皮细胞在损伤处的修复[16]。

2.参与调节免疫反应，降低炎症反应：ITF不仅参与黏液屏障的组成，还通过阻止肠道炎症反应来保护胃肠黏膜。研究[17]报道ITF通过抑制单核细胞iNOS/NO调节结肠炎NO介导的炎症反应。Teng等[18]给予结肠炎小鼠注射rhITF，结果显示肠道损害减轻，炎症介质肿瘤坏死因子（TNF）-α、Toll样受体 4（TLR4）、NF-κB表达降低，其机制可能为 ITF可阻断TLR4/NF-κB信号通路。尽管ITF在免疫反应中起一定作用，其并不是直接通过树突细胞来调节由脂多糖（LPS）介导的免疫反应[19]，具体的调节机制仍有待进一步研究。

3.抗细胞凋亡作用：ITF抗凋亡信号系统目前尚不完全清楚。细胞凋亡对确保正常发育、生长以及维持内环境稳定有重要的作用，凋亡过程由复杂的基因网络所调控，并受到相关细胞因子影响。目前认为凋亡主要有两条调节途径：①线粒体通路（内源性途径）：该通路的活化由促凋亡因子如BAX和BAK以及抑制因子Bcl-2和Bcl-xl之间的平衡所调节，p53是这一过程重要的调节分子；②细胞表面死亡受体通路（外源性途径）：细胞表面的蛋白质与携带凋亡信号的专一性配体结合，诱导细胞凋亡，如Fas/FasL凋亡途径。上述两条通路最终均激活caspase，进而执行细胞凋亡。Taupin等[20]的实验发现ITF缺失小鼠的结肠细胞凋亡增加且不伴随Fas或Bcl家族表达的改变；高表达ITF的结肠细胞株（HT-ITF1）能抵抗由神经酰胺和血清饥饿诱发的细胞凋亡；外源性ITF可保护人结肠肿瘤细胞株HCT-116和IEC-6细胞凋亡；且这种作用可被酪氨酸磷酸化抑制剂A25所抑制，提示其可能与磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）和表皮生长因子受体（EGFR）活化有关。AGS胃癌细胞中p53依赖的细胞凋亡可被C末端未发生剪切突变的ITF所抑制，且PI3K和EGFR须功能良好。由此可见，ITF是内源性胃肠道具有抗凋亡特性的肽类物质。ITF能促进IEC-18细胞[21]和SW837结肠癌细胞[22]中转染表达人类ITF载体NF-κB p50/p65异源二聚体的活性，且能增强IEC-18细胞的抗凋亡能力，此外，NF-κB阻断剂能显著降低ITF诱导的IEC-18细胞的抗凋亡能力，推测ITF能通过NF-κB途径增强IEC-18的抗凋亡能力。ITF的抗凋亡作用可能是其在肿瘤和IBD等疾病中的重要作用机制之一，需进一步研究探讨。

三、ITF的黏膜修复机制

1.促进肠上皮细胞移行：黏膜上皮细胞损伤后早期修复的关键环节是细胞迁移，即损伤区域周边的细胞迁移到损伤区，重建上皮的完整性并重组黏膜屏障[15,23]。上皮细胞间通过位于侧膜上的连接复合体而相互黏附，这种连接复合体由三种咬合在一起的成分组成：紧密连接、黏附连接以及桥粒[24,25]。紧密连接由多种蛋白质参与形成，主要包括闭锁蛋白（occludin）、闭合蛋白（claudin）、闭锁小带（zona occludens,ZO）、连接黏附分子等。黏附连接发生在相邻细胞的钙黏蛋白（cadherin）分子之间，由Ca2+介导。如紧密连接或黏附连接等发生破坏或功能改变，即发生细胞迁移。ITF在体内外均能促进多种细胞的迁移，可能与 APC蛋白、β-catenin、E-cadherin、EGFR复合体、ERK等关系密切。研究[26]发现细胞因子和生长因子促进肠黏膜的修复需转化生长因子（TGF）-β介导，而ITF对上皮的修复作用不依赖TGF-β，其通过促进损伤周围细胞迁移到破损处进行精密修复。ITF通过上皮细胞cadherin降低细胞间连接，促进细胞移行。上皮细胞cadherin是相对分子质量为12000的跨膜蛋白，其细胞外部分介导细胞间的紧密连接，细胞内部分通过catenin与细胞骨架的微丝系统相连。ITF通过影响上皮细胞间catenin的表达和定位，以及诱导catenin的酪氨酸磷酸化，从而降低细胞间的紧密连接，促进上皮细胞移行。ITF促进肠上皮细胞移行还涉及Ras信号转导途径，并与EGF信号转导途径密切相关。ITF可能通过酪氨酸或双异磷酸酶活性调节细胞内信息通道，抑制ERK和MAPK的部分通道。ITF可直接刺激ERK磷酸化，而不经EGF受体磷酸化，既不需要完整的三叶基序，又无需二聚化而可完成促进细胞移行的作用。目前对ITF是否促进上皮细胞分化尚不清楚。有研究[13]表明ITF的修复作用需杯状细胞的分化、成熟以及其与黏蛋白的组装和分泌。

目前ITF介导修复的具体信号转导通路尚未完全清楚。Kalabis等[27]通过质谱分析发现Vangl1在接受ITF刺激后发生Ser/Thr磷酸化，减少了细胞膜间E-cadherin的连接，促进小肠上皮细胞的创伤愈合。因而Vangl1可能是介导ITF修复小肠黏膜的效应器。

2.促进血管增殖，与EGF协同增效：黏膜重建还需丰富的黏膜血流供应，ITF和其他相关生长因子可促进血管生成[28]，从而促进黏膜修复。ITF与EGF在多种损伤模型中发挥协同增效的作用，EGF引起的离子迁移亦有调节作用。在各种不同的细胞株中，给予ITF后，EGF受体和ErbB-2发生磷酸化[29]。目前尚未证实ITF与EGFR有直接的联系，推测EGFR可能发生一种间接的转活。

3.与受体作用，促进细胞增殖：ITF可能通过与其受体结合来发挥修复黏膜的功能。动物实验[30]中小剂量皮下给药即可显示ITF的保护功能，说明可能存在三叶肽特异性受体或转运蛋白。但目前尚缺乏明确的证据。有研究[31]推测PDZD2可能与ITF密切相关，其受体可能是具有PDZ结构域或类似PDZ结构域的一种新蛋白。ITF与PDZD结合后，使PDZD2蛋白构象发生改变，暴露PDZ结构域，从而与Vangl1结合，通过Ser/Thr磷酸化，使其失去结合Dsh的能力，解除Vangl1对Dsh的抑制作用，从而使Wnt信号能顺利向下游传递，发挥促细胞移行的作用。Wnt8b、ITIH4可能是ITF受体的候选蛋白，有待进一步筛选研究。

四、ITF与IBD关系

IBD病因不明确，可能与遗传、环境、感染和免疫均有关，细胞因子参与免疫反应和炎症过程，是当前研究IBD发病机制的热点之一。TNF-α等细胞因子在IBD发病中的作用已得到公认，但其释放和调控机制尚不明确，近年集中于TLRs/NF-κB通路，而研究[17]表明ITF可阻断该通路，且外源性给予、局部给予和促内源性增加ITF，均能使黏膜凝胶的稳定性提高，促进黏膜损伤愈合，加快修复。ITF的促进黏膜愈合作用[32]，可能使其成为治疗IBD的新方案。

五、结语

ITF作为一种新的胃肠黏膜保护因子，目前其作用受到广泛重视。其既能与黏蛋白结合形成凝胶，增强黏膜防御功能，促进肠上皮细胞移行，加速损伤修复，保持肠黏膜完整，从而减轻电解质丢失和免疫所致的肠道炎症反应；同时有具有抗酸、耐酶以及热分解的生物学特性，从而有望成为预防和治疗IBD的一种新途径。但目前仍应进一步阐明ITF多肽分子的功能，鉴定其受体或结合蛋白，并阐明各级信号通路。

1 Suemori S, Lynch-Devaney K, Podolsky DK.Identification and characterization of rat intestinal trefoil factor:tissue-and cell-specific member of the trefoil protein family[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1991,88(24):11017-11021.

2 Seib T,Blin N,Hilgert K,et al.The three human trefoil genes TFF1,TFF2,and TFF3 are located within a region of 55 kb on chromosome 21q22.3[J].Genomics,1997,40(1):200-202.

3 杜廷义,张勇,张云.三叶因子：从实验室研究到临床医学[J].动物学研究,2010,31(1):17-26.

4 Kouznetsova I,Kalinski T,Peitz U,et al.Localization of TFF3 peptide in human esophageal submucosal glands and gastric cardia:differentiation of two types of gastric pit cells along the rostro-caudal axis[J].Cell Tissue Res,2007,328(2):365-374.

5 Taupin D,Pedersen J,Familari M,et al.Augmented intestinal trefoil factor (TFF3)and loss of pS2(TFF1)expression precedes metaplstic differentiation of gastric epithelium[J].Lab Invest,2001,81(3):397-408.

6 Hinz M,Schwegler H,Chwieralski CE,et al.Trefoil factor family(TFF)expression in the mouse brain and pituitary:changes in the developing cerebellum[J].Peptides,2004,25(5):827-832.

7 Vestergaard EM,Nexo E,Wendt A,et al.Trefoil factors in human milk[J].Early Hum Dev,2008,84(10):631-635.

8 Samson MH,Poulsen SS,et al.Trefoil factor family peptides in the human foetus and at birth[J].Eur J Clin Invest,2011,41(7):785-792.

9 Kadri SR,Lao-Sirieix P,O’Donovan M,et al.Acceptability and accuracy of a non-endoscopic screening test for Barrett’s oesophagus in primary care:cohort study[J].BMJ,2010,341:c4372.

10 Yio X,Zhang JY,Babyatsky M,et al.Trefoil factor family-3 is associated with aggressive behavior of colon cancer cells[J].Clin Exp Metastasis,2005,22(2):157-165.

11 Vestergaard EM,Borre M,Poulsen SS,et al.Plasma levels of trefoil factors are increased in patients with advanced prostate cancer[J].Clin Cancer Res,2006,12(3 Pt 1):807-812.

12 Khoury T,Chadha K,Javle M,et al.Expression of intestinal trefoil factor (TFF-3) in hepatocellular carcinoma[J].Int J Gastrointest Cancer,2005,35(3):171-177.

13 Kim YS,Ho SB.Intestinal goblet cells and mucins in health and disease:recent insights and progress[J].Curr Gastroenterol Rep,2010,12(5):319-330.

14 Renes IB,Verburg M,Van Nispen DJ,et al.Epithelial proliferation,cell death, and gene expression in experimental colitis:alterations in carbonic anhydrase I,mucin MUC2,and trefoil factor 3 expression[J].Int J Colorectal Dis,2002,17(5):317-326.

15 王焕,吴修文,万千雪,等.肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞增殖移行能力变化的影响[J].中华烧伤杂志,2011,27(5):347-352.

16 吴修文,王焕,万千雪,等.肠三叶因子和黏蛋白对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响[J].中华烧伤杂志,2011,27(5):341-346.

17 Baus-Loncar M,Kayademir T,Takaishi S,et al.Trefoil factor family 2 deficiency and immune response[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(24):2947-2955.

18 Teng X,Xu LF,Zhou P,et al.Effects of trefoil peptide 3 on expression of TNF-alpha,TLR4,and NF-kappaB in trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis mice[J].Inflammation,2009,32(2):120-129.

19 Loos M,De Creus A,Thim L,et al.Murine trefoil factor 3 does not directly modulate LPS-mediated dendritic cell function[J].Scand J Immunol,2007,66(1):35-42.

20 Taupin DR,Kinoshita K,Podolsky DK.Intestinal trefoil factor confers colonic epithelial resistance to apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(2):799-804.

21 Chen YH,Lu Y,De Plaen IG,et al.Transcription factor NF-kappaB signals antianoikic function of trefoil factor 3 on intestinal epithelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,274(3):576-582.

22 Uchino H,Kataoka H,Itoh H,et al.Overexpression of intestinal trefoil factor in human colon carcinoma cells reduces cellular growth in vitro and in vivo[J].Gastroenterology,2000,118(1):60-69.

23 Niessen CM.Tight junctions/adherens junctions:basic structure and function[J].J Invest Dermatol,2007,127(11):2525-2532.

24 Hoffmann W.Trefoil factors TFF (trefoil factor family)peptide-triggered signals promoting mucosal restitution[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(24):2932-2938.

25 Kjellev S.The trefoil factor family-small peptides with multiple functionalities[J].Cell Mol Life Sci,2009,66(8):1350-1369.

26 Sturm A,Dignass AU.Epithelial restitution and wound healing in inflammatory bowel disease[J].World J Gastroenterol,2008,14(3):348-353.

27 Kalabis J,Rosenberg I,Podolsky DK.Vangl1 protein acts as a downstream effector of intestinal trefoil factor(ITF)/TFF3 signaling and regulates wound healing of intestinal epithelium[J].J Biol Chem,2006,281(10):6434-6441.

28 Krishnan K,Arnone B,Buchman A.Intestinal growth factors:potential use in the treatment of inflammatory bowel disease and their role in mucosal healing[J].Inflamm Bowel Dis,2011,17(1):410-422.

29 Taupin D,Wu DC,Jeon WK,et al.The trefoil gene family are coordinately expressed immediate-early genes:EGF receptor-and MAP kinase-dependent interregulation[J].J Clin Invest,1999,103(9):R31-R38.

30 Li J,Zhou R,He WC,et al.Effects of recombinant human intestinal trefoil factor on trinitrobenzene sulphonic acid induced colitis in rats[J].Mol Biol Rep,2011,38(7):4787-4792.

31 王林.肠三叶肽因子受体的分离、鉴定及其生物学信息分析[D].上海:第三军医大学,2009.

32 Podolsky DK,Gerken G,Eyking A,et al.Colitisassociated variant of TLR2 causes impaired mucosal repair because of TFF3 deficiency[J].Gastroenterology,2009,137(1):209-220.