共培养环境中兔角膜内皮细胞诱导人iPSCs分化*

谭美华， 陈建苏， 招志毅， 丁 勇， 钟敬祥， 戴 应， 李善义， 杨皓庄

(暨南大学1第一临床医学院眼科，2医学院眼科研究所，3再生医学教育部重点实验室，4医学院病理生理学系，广东广州510632)

人体内角膜内皮细胞(corneal endothelial cells，CECs)形成成熟单细胞层后一般失去增殖能力，在受到损伤和丢失后主要靠周边内皮细胞的扩大和移行修复，而供体材料匮乏和免疫排斥反应使角膜移植治疗角膜内皮疾病受到限制［1］。2006年，Takahashi等［2］首次将小鼠成纤维细胞体外重编程为类似胚胎干细胞的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，这种体细胞来源的干细胞避免了道德伦理问题和免疫排斥的缺点，迅速成为干细胞领域的研究热点［3－4］。利用iPSCs作为种子细胞来源，构建组织工程角膜内皮为临床治疗角膜内皮疾病提供了新的思路。本实验通过建立 iPSCs与兔CECs的混合共培养模式，用原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)结合倒置显微镜观察共培养前后iPSCs的形貌和超微结构变化，初步探讨混合共培养诱导iPSCs分化的表征变化;在此基础上，用量子点对iPSCs进行标记示踪，对共培养一定时间后iPSCs膜蛋白的表达变化进行检测，研究此共培养体系促进iPSCs向角膜内皮样细胞分化的潜能，为进一步研究iPSCs向CECs的分化提供实验依据。

材料和方法

1 材料与试剂

人脐带源iPSCs(中国科学院广州生物医药与健康研究院惠赠);mTeSR1培养基(WiCellTM研究所); Y27632(Sigma－Aldrich);高糖DMEM培养基(Gibco);兔抗人Oct4、Nanog和Sox2抗体 (Cell Signaling);兔抗人水通道蛋白1(aquaporin 1，AQP1)抗体、鼠抗人 CD34抗体和羊抗鼠 IgG抗体(Santa Cruz);鼠抗人CD133抗体(Miltenyi Biotec);兔抗人CD31抗体(博奥森);鼠抗兔IgG抗体(Chemicon);量子点活细胞示踪试剂盒(武汉珈源);荧光显微镜(Leica);原子力显微镜(BioScope Catalyst);三维去卷积实时活细胞成像系统(荧光)(API－DVCore);倒置显微镜(Olympus)。

2 方法

2.1 兔CECs的分离与培养 取新西兰大白兔空气栓塞致死，无菌条件下摘取眼球，PBS冲洗3次，放入含1×106U/L庆大霉素的PBS中，4℃冰箱浸泡30 min。环形剪下整片角膜组织，置于含5×105U/L青霉素、100 mg/L链霉素的双抗PBS中，内皮面朝上，解剖显微镜下小心剥离后弹力膜和内皮层，移入无菌培养皿中，将卷曲大片的透明后弹力膜撕成小块，双抗PBS冲洗，加入0.25%胰蛋白酶常温消化10 s，吸弃胰酶，加入内皮细胞培养基即含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM，反复吹打组织片50～60次，将悬液和后弹力膜一起移入6孔板，放入37℃、5% CO2培养箱中孵育。48 h后换液，以后每3 d更换1次培养基。细胞融合至80%时吸弃培养基，0.25%胰酶37℃消化10 min，内皮细胞培养基终止消化，反复吹打使细胞脱落，1 200 r/min、离心5 min，加入内皮细胞培养基重悬，1∶2传代培养，做成爬片。

2.2 人iPSCs的扩增培养 37℃水浴箱解冻第31代人脐带源iPSCs系［5］，转移至15 mL离心管中，逐滴加入9 mL含体积分数0.1%Y27632的mTeSR1培养基，15～25℃、1 450 r/min离心5 min，弃上清，加入2 mL上述培养基，轻轻吹打重悬细胞，转移至6孔板，放入37℃、5%CO2培养箱中孵育，24 h后改用mTeSR1培养基换液。每天倒置显微镜观察，辨认克隆周边分化的细胞并及时刮弃，保持高纯度的未分化状态iPSCs，每天更换培养基，5～7 d传代。

2.3 人iPSCs的鉴定 收集1×106iPSCs裂解后的上清液，进行SDS－PAGE电泳。电转移到PVDF膜上，洗涤液漂洗2 min，再将PVDF膜浸入5%封闭液中，4℃振荡1 h，将PVDF膜分别与兔抗人Oct4、Nanog、Sox2抗体(1∶1 000)和兔单克隆β－actin抗体(1∶3 000)4℃孵育过夜，洗涤液洗涤3次，每次5 min，加入羊抗兔IgG抗体(1∶3 000)室温孵育1 h，ECL法显色，显影剂孵育1 min，定影剂孵育0.5 min。2.4 人iPSCs的标记 未分化iPSCs扩增培养7 d后1∶4传代，传代后第4 d取3孔进行标记。根据量子点活细胞示踪试剂盒说明书的步骤并调整浓度操作如下:分别取3 μL、4.5 μL和6 μL组分A，另取等体积组分B与组分A混匀，室温孵育5 min，分别用594 μL、591 μL和588 μL mTeSR1培养基将A与B的混合液稀释成应用液，量子点的浓度分别为5 nmol/L、7.5 nmol/L和10 nmol/L。取3孔iPSCs，吸弃培养基，PBS洗涤2次，分别加入配好的3种不同浓度应用液，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h，吸弃标记液，PBS洗涤2次，加入mTeSR1培养基，置于孵箱继续培养，每天换液，3 d后，用荧光三维去卷积实时活细胞成像系统观察标记效果并拍照。

2.5 人iPSCs与兔CECs混合共培养 取3孔已用最佳浓度量子点标记的iPSCs，培养3 d后吸弃培养基，加入0.05%胰酶37℃消化3 min，吸走胰酶，mTeSR1培养基清洗2遍，加入mTeSR1培养基，用机械法轻轻刮起iPSCs，同时吹打帮助细胞脱落，分别取悬液的1/4、1/3和1/2加入到已经融合60%的兔CECs爬片中，均加入内皮细胞培养基，37℃、5% CO2培养箱中孵育培养，24 h后第1次换液，之后每2 d用内皮细胞培养基换液1次。

2.6 AFM观察 共培养过程中，每天倒置显微镜观察，记录3种细胞的形态变化。7 d后，取最佳比例共培养的细胞，吸弃培养基，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，取出爬片自然风干，固定于AFM载物台上，普通光选取要采集图像的细胞，转换为RTESP探针，以轻敲模式扫描。所用悬臂的弹性系数k为20～80 N/m，共振频率为278～317 kHz，扫描速度0.5 Hz，图像像素256×256 pixel，经自带分析软件进行3种细胞的全貌、细胞直径、核直径以及近核处5 μm小区域细胞膜的均方根粗糙度和平均粗糙度等参数的测量和分析。

2.7 免疫荧光检测 以最佳比例混合共培养2周后，取4孔细胞吸弃培养基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，配置的BSA－TBST室温透膜30 min，10%胎牛血清封闭1 h，分别加入兔抗人CD31抗体、兔抗人AQP1抗体、鼠抗人CD133抗体和鼠抗人CD34抗体，4℃冰箱孵育过夜。PBS洗涤后，前两者加入鼠抗兔IgG抗体，后两者加入山羊抗鼠IgG抗体，均常温孵育1 h，DAPI染色液室温作用15 min，PBS清洗，激光共聚焦显微镜观察并拍照，取4孔正常培养7 d的iPSCs按相同的步骤染色作为对照。

结果

1 兔角膜内皮细胞生长形态

原代兔角膜内皮细胞分离培养48 h后大部分已贴壁，未被吹散的成团细胞贴壁后开始向周围移行增殖，2周后细胞达80%融合，细胞呈多边形，紧密排列呈铺路石样。传代24 h后，角膜内皮细胞大部分贴壁，第3～5 d生长活跃(图1)，1周达生长密集状态，形态呈六边形或椭圆形。

Figure 1.The morphology of primary rabbit corneal endothelial cells(CECs)cultured for 5 d(×100).图1 兔角膜内皮细胞原代培养5 d的形态

2 人iPSCs的生长形态及鉴定

人iPSCs呈克隆生长，增殖较快，5～7 d可达90%融合。单个iPSC细胞核约占整个细胞的2/3，核浆比较大，可见2～3个核仁。Western blotting检测显示iPSCs的Oct4、Nanog和Sox2蛋白均表达阳性，见图2。

Figure 2.The expression of Nanog，Oct4 and Sox2 detected by Western blotting.M:protein marker.图2 Western blotting检测Nanog、Oct4和Sox2蛋白的表达

3 人iPSCs的标记

量子点可标记共培养的人iPSCs，量子点荧光标记呈浓度正相关依赖，浓度为10 nmol/L的量子点应用液对iPSCs标记效果最佳，见图3。

4 倒置显微镜观察

共培养24 h后倒置显微镜观察，iPSCs开始在CECs间隙贴壁克隆样生长。1/3悬液的iPSCs贴壁克隆较多，细胞生长较快，小克隆逐渐融合，抑制CECs的生长;1/2悬液的iPSCs贴壁较多，融合形成的iPSCs大克隆显著抑制内皮细胞的生长;1/4悬液的iPSCs生长良好，贴壁后的小克隆与角膜内皮细胞均继续扩增，且新扩增的iPSCs体积逐渐变大，胞浆增多，兔CECs逐渐由六边形变成椭圆甚至长梭形，见图4。

5AFM观察

用AFM对第1代兔CECs和共培养前后iPSCs作全貌及细胞膜小区域超微结构扫描，结果见图5。图5A是3种细胞的二维、三维和峰值误差图，可观察到单层培养的第1代兔CECs表面粗糙，膜上分布着密集的大小不等颗粒状突起物;共培养前iPSCs表面较光滑，未见明显的颗粒;共培养7 d后iPSCs膜表面不再平滑，可见颗粒状突起分布，粗糙度较前明显增加。测量每个细胞及其细胞核的直径，计算细胞核与细胞直径之比，统计分析结果显示3种细胞两两之间均有统计学意义(P＜0.05)，见图5B，即iPSCs经共培养诱导后核浆比逐渐变小，说明iPSCs从形态上开始向内皮样细胞转化。取近核处细胞膜进行5 μm小区域超微结构扫描，发现共培养前后iPSCs均方根粗糙度Rq和平均粗糙度Ra比较均有统计学意义(P＜0.05)，见图5C、D。共培养后iPSCs粗糙度较前明显增加，与形貌图的观察结果一致。

Figure 5.The morphology of rabbit CECs and human iPSCs before and after mixed culture observed by atomic force microscopy.A:two－dimensional(2D)，three－dimensional(3D)and peak force error images;B:statistical chart of the ratio of diameter of diameter of nucleus to cell;C:statistical chart of the mean square root roughness(Rq);D:statistical chart of the average roughness(Ra).±s.n=20.*P＜0.05 vs CECs;△P＜0.05 vs iPSCs.图5 原子力显微镜观察兔CECs和共培养前后人iPSCs的形貌

6 免疫荧光检测

混合共培养前iPSCs中CD31、AQP1、CD133和CD34蛋白均未见表达;共培养2周后，iPSCs表达AQP1呈阳性，见图6，其它3种蛋白表达阴性。

Figure 6.Aquaporin 1 was expressed positively in human iPSCs after mixed－cultured with rabbit CECs for 2 weeks(under confocal microscope).图6 分化后人iPSCs表达AQP1呈阳性

讨论

目前，在特定条件下 iPSCs可被诱导分化为心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、神经元等［6－8］。将自体iPSCs作为组织工程角膜的种子细胞，利用其多向分化潜能，在特定条件下诱导分化为角膜内皮细胞，这一思路的可行性将为眼科临床治疗角膜内皮疾病提供新的途径。

细胞共培养体系在维持细胞基本结构和性状的基础上，使体内外环境尽可能相吻合，有利于构建更加接近生理状态的重建体外细胞组织。混合细胞共培养既有细胞因子的流通，又有细胞之间的接触作用，是研究直接接触共培养促进干细胞分化的一种有效方式［9－10］。原子力显微镜利用探针在样品表面进行逐级光栅扫描得到样品表面的形貌，它可在空气或各种近生理条件的溶剂体系中直接观测样品表面形貌和结构特征，进行高精度的微观测量，分辨率高，制样简单，操作性好，成像时间短，在生物医学领域广泛应用于细胞形态分析［11－12］。干细胞的标记对干细胞移植效果的评估和治疗方案的优化极为重要，而功能化纳米材料的标记技术是干细胞示踪的新途径。量子点作为一种新型荧光染料，它激发波长宽，发射波长窄，发光性能强，抗光漂白能力强，荧光寿命长，这些优良的光学和化学特性使得量子点成为生物医学标记应用的一项重要技术［13］。在三维去卷积实时活细胞成像系统可以较好地显示出量子点与膜表面蛋白双标记效果。

本实验用一种新的胰酶快速消化法分离培养出具有典型多边形结构和铺路石样外观的兔CECs，并用无饲养层细胞培养法扩增培养人iPSCs，避免了饲养层培养体系中可能出现的细胞混杂问题;倒置显微镜下及时挑走分化细胞以获得保持未分化状态的人iPSCs;对人iPSCs进行量子点标记示踪，可以区别分化后的人iPSCs和兔CECs，且利于长期共培养后目的细胞的检测和分选。设计了不同的细胞比例进行混合共培养，在最适宜条件下观察两者的相互影响和诱导效果。在倒置显微镜和AFM观察到分化后的人iPSCs形态和膜粗糙度均发生变化，体积增大，胞浆增多，核浆比减小，细胞均方根粗糙度和平均粗糙度均增加。另外，本实验选用CD34和CD133膜表面蛋白检测是内皮干细胞的标志物，CD31也在内皮细胞连接处高表达，而AQP1是角膜内皮最主要的一个水通道蛋白［14］，结果显示本实验条件下iPSCs具有向角膜内皮样细胞转化的特征。

综合这些结果，量子点标记共培养的人iPSCs呈浓度正相关依赖，10 nmol/L量子点标记的iPSCs以1/4悬液与融合60%的兔CECs共培养可获得最佳混合共培养和标记效果。本实验所用混合共培养方法可诱导人iPSCs从形态学变化上和AQP1表达上向角膜内皮样细胞方向分化。产生这些变化的机制是兔CECs分泌细胞因子的诱导作用，还是2种细胞直接接触作用，或是这两者的双重作用，还有待进一步观察和研究。

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