FISH联合multiplex RT－PCR检测MLL基因重排的价值探讨

何 易， 李旭东， 王东宁， 肖若芝， 王文文， 胡 元， 林东军△

(中山大学1附属第三医院血液科，2血液病研究所，广东广州510630)

涉及11q23的染色体异常是造血系统肿瘤中常见的遗传学改变，分子水平研究揭示此异常导致位于11q23的混合谱系白血病(mixed－lineage leukemia，MLL)基因发生重排，此基因亦被称为 ALL1、HTRX、HRX或TRX1基因。MLL异常可分为两类，一类为MLL重排，包括涉及MLL的易位、倒位和串联重复序列(partial tandem duplication，PTD);第二类为MLL扩增，包括多倍体、均匀染色区(homogeneously staining region，hsr)和双微染色体(double minutes，dmin)以及标记染色体(marker chromosome，mar)。WHO已将涉及11q23/MLL基因重排的急性白血病单独列为11q23/MLL白血病，累及的白血病大多恶性程度高，对常规化疗不敏感，生存期短，是预后差的独立因素［1－2］，而早期进行造血干细胞移植可能为改善预后带来好处［3－4］。因此，MLL基因重排的检测对急性白血病(acute leukemia，AL)预后判断和治疗方案选择具有重要意义。我们对201例已进行常规染色体核型分析(conventional cytogenetics analysis，CCA)的AL患者回顾性地总结荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)和逆转录多重巢式聚合酶链反应技术(reverse transcriptionmultiplex nested PCR，multiplex RT－PCR)对MLL基因异常的检出率，探讨两者联合应用的价值。

材料和方法

1 研究对象

自2008年1月～2011年5月于我院住院并行常规CCA、FISH和multiplex RT－PCR检测的原发AL患者共201例，包括急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者128例及急性淋巴细胞白血病(acute lymphoid leukemia，ALL)患者73例。共检出19例MLL基因重排患者，其中13例为AML，按FAB分型M5 10例，M4 2例，M2 1例;6例为ALL。19例患者中男12例，女7例，中位年龄25.5 (2～68)岁。所有病例均进行形态学、免疫学、分子生物学和细胞遗传学(MICM)分型。

2 方法

2.1 细胞遗传学分析 取患者治疗前骨髓3 mL，采用短期培养法培养骨髓24 h，终止培养前1 h加0.05 g/L秋水仙碱，按常规方法制备染色体，采用RHG显带技术进行核型分析，染色体核型描述参照ISCN2005的标准。

2.2 间期FISH检测 采用染色体短期培养法的标本，气干法滴片，并于2×SSC中洗片2 min，70%、85%、100%乙醇梯度脱水各2 min，加入MLL breakpoint探针(Cytocell)，实验方法按说明书操作。橡皮水泥密封，37℃恒温杂交仪过夜，次日洗片后用含0.1 mg/L二咪基苯基吲哚(DAPI)的抗褪色液复染标本10 min后在荧光显微镜下观察，分析间期细胞200个。11q23/MLL基因重排阴性的细胞显示2个黄色融合信号(0R0G2Y)，重排阳性的细胞显示1个黄色融合信号和1个红色及1个绿色信号(1R1G1Y)，MLL扩增显示为3个以上的黄色融合信号。

2.3 中期FISH检测 方法同间期FISH，选择分散较好的中期分裂相在荧光显微镜下观察MLL信号。

2.4 Multiplex RT－PCR检测 取治疗前EDTA抗凝的骨髓2 mL，采用 Trizol(Invitrogen)试剂提取(1～2)×106个有核细胞总RNA，用Maxima试剂盒(Fermentas)反转录为cDNA。MLL融合基因引物设计及检测方法参照文献［5］进行。2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪(Tanon 2500)软件分析。共检测11种较常见的MLL融合基因，包括:MLL/AFX、MLL/ AF1p、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/AF9、MLL/AF10、dupMLL(11q23)、MLL/AF17、MLL/ELL和MLL/ENL。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析，分类资料用χ2检验。

结果

1 间期FISH正常分界值的确定

正常分界值的计算为阴性对照组中所观察到的阳性细胞数的均数±3×标准差。阴性对照组为10例经骨髓形态学确诊的患者，包括特发性血小板减少性紫癜4例，缺铁性贫血4例，大致正常骨髓象2例。间期FISH检测该组阳性细胞百分率为1%～2.5%，均数为2%，标准差为0.51%，分界值=2%+ 3×0.51%=3.53%。将阳性细胞百分率大于该值的标本定为MLL基因重排阳性。

2 CCA、FISH和multiplex RT－PCR检测结果

共有19例患者出现11q23/MLL基因重排，见表1。在AML中检出13例(13/128，10.2%)，ALL中检出6例(6/73，8.2%)。11例(11/201，5.47%)经CCA检测到11q23异常，分别为:t(4;11)伴+11 1例，t(6;11)2例，t(9;11)2例，t(10;11)3例，t(11; 19)3例。FISH检测见15例(15/201，7.46%)出现阳性MLL异常信号，其中11例为MLL分离信号，2例为扩增信号，同时出现分离和扩增信号的2例。第4例患者CCA正常，中期FISH见MLL分离的红绿信号分别位于11号染色体的长短臂上，提示inv (11)，见图1。18例患者(18/201，8.86%)检出MLL融合基因阳性表达，分别为:dup MLL(11q23)6例，MLL/AF6 2例，MLL/AF10 3例，MLL/AF9 2例，MLL/ ELL 2例，MLL/ENL、MLL/AF4和 MLL/ELL伴 dup MLL(11q23)各1例，见表1。

表1 19例11q23/MLL基因重排阳性患者核型、FISH和PCR结果Table 1 .The results of karyotype，FISH and PCR in 19 MLL－positive cases

Figure 1.FISH results of the MLL probe.MLL gene exhibit yellow fluorescent.The break－apart of red and green signals stands for MLL rearrangement.图1MLL探针的FISH结果

3 CCA与FISH、multiplex RT－PCR联合检测的比较

将CCA中无11q23重排的患者分为2组，一组为正常核型组，另一组为其它附加染色体异常组。5例正常核型组患者经FISH检测1例为inv(11)，1例为MLL扩增;multiplex RT－PCR检出4例dup MLL (11q23)。3例具有其它染色体异常的患者中1例为超二倍体，FISH检测发现MLL扩增，1例 +8，FISH未发现异常，这2例患者multiplex RT－PCR检出均为 dup MLL(11q23);第3例患者为四倍体，FISH检测发现MLL重排并扩增，multiplex RT－PCR检出MLL/ELL并dup MLL(11q23)，见图2。FISH联合multiplex RT－PCR检出MLL异常率为9.45% (19/201)，较CCA检出MLL异常率(5.47%)明显提高，χ2=100.558，P＜0.01。19例MLL阳性的患者中，CCA敏感度为57.9%(11/19)，FISH敏感度为78.9%(15/19)，multiplex RT－PCR敏感度为94.7%(18/19)。

Figure 2.PCR results for MLL rearrangement.A:dup(MLL) positive product.Lane 1:MLLex5/MLLex2.B:MLL/ ELL(+)product.Lane 1，2:CBF/MYH11;Lane 3: MLL/AFX Lane 4:MLL/AF6;Lane 5:MLL/ELL.M:DNA marker.图2MLL重排的PCR结果

讨论

染色体易位是白血病常见的遗传学改变，不同染色体或同一染色体不同区段易位后可造成2个基因融合，从而导致相应基因功能的异常获得或丧失，使细胞发生恶性转化并出现增生异常、分化障碍和凋亡减少。MLL易位、串联重复和扩增等可造成HOX基因的持续表达而分化失控，导致造血干细胞恶变［6］。MLL重排是白血病重现性的遗传学改变之一，具有MLL重排的急性白血病对常规化疗反应差，对急性白血病的分型诊断、治疗方案选择和预后评价有指导意义，因此是急性白血病的常规检查项目。CCA能全面分析人类23对染色体异常情况，是分析11q23重排的常用方法，但由于受染色体中期分裂相数量和质量以及染色体隐匿易位或PTD的影响，CCA将导致部分11q23异常漏检。MLL重现性易位已达100种以上，已鉴定的伙伴基因达60多种［7］，庞大的易位种类也给CCA带来一定的困难。本研究中CCA检出11q23重排的敏感度为57.9%，而FISH和multiplex RT－PCR检出MLL敏感度分别为78.9%和94.7%，提示CCA并非为检测11q23/MLL重排的敏感方法。

FISH是结合了细胞遗传学、分子生物学和免疫学的一种新技术，具有快速直观、敏感性和特异性高、可重复性好等特点。间期FISH不受染色体质量的影响，可用于单细胞水平的直接观察［8－9］。11q23/MLL易位的断裂点绝大多数发生在8.5 kb的BamH I酶切片段、包含了外显子5～11的断裂集中区(breakpoint cluster region，BCR)，我们使用的11q23/MLL双色分离信号探针正是以BCR为界线，用2个DNA片段以不同的荧光染料分别标记MLL基因断裂集中区的中心粒端和端粒端。11q23/MLL双色分离探针在间期细胞中易于观察累及11q23/ MLL的各种易位、缺失和扩增而无需预先知道伙伴基因，但不能判断倒位、插入和PTD。结合中期FISH则可明确易位的伙伴基因、倒位和插入。本研究中第4例患者CCA未见异常，于间期细胞中仅见分离信号，而中期分裂相上见MLL分离的红绿信号分别位于11号染色体的长短臂上，证实为 inv(11)。FISH检出的4例MLL扩增，包括多倍体和mar，CCA只报告了1例11三体和1例四倍体。这提示FISH能检出CCA难以发现的MLL隐匿易位、倒位和扩增，其敏感性要高于CCA。

MLL与伙伴基因融合后转录出融合基因转录本，虽然涉及的伙伴基因众多，但以MLLT2(AF4)、MLLT3(AF9)、MLLT1(ENL)、MLLT10(AF10)和MLLT4(AF6)出现频率最高［10］。多数研究表明具有MLL基因重排的患者对常规化疗反应差，预后不良，尤其年龄小于1岁的婴幼儿治疗效果更差［1－2］。PTD为MLL自身融合的形式，具有MLL－PTD的患者同样生存期也较MLL－PTD阴性者短［11］。我们采用的multiplex RT－PCR方法中包含了MLL/AFX、 MLL/AF1P、MLL/AF1q、MLL/AF4、MLL/AF6、MLL/ AF9、MLL/AF10、MLL/AF17、MLL/ELL和 MLL/ENL等常见的融合基因，也包含了dupMLL(11q23)这种不能被CCA和FISH方法检测出的串联重复形式。本研究确定了12例MLL的伙伴基因，还检出了7例dupMLL(11q23)，弥补了CCA和FISH的不足。

综上所述，FISH的双色分离探针能够检测间期细胞和中期分裂相上的MLL信号，无需预先知道伙伴基因，其检测范围大大高于multiplex RT－PCR;而multiplex RT－PCR能够明确常见的MLL融合基因及其伙伴基因，还能检出FISH无法测到的MLLPTD，两者结合显著提高了MLL重排的检出率。

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