黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因克隆及在毕赤酵母中分泌表达

朱龙宝，汤 斌，陶玉贵，葛 飞，魏胜华，陈 涛，李婉珍

（安徽工程大学 生化学院，安徽 芜湖 241000）

纤维素是重要的可再生生物质资源，在解决能源和环境问题中起到重要作用。纤维素酶高效水解纤维仍然是生物法生产燃料乙醇的一个技术瓶颈[1]。纤维素被降解为葡萄糖至少需要3种纤维素酶，分别是β-1，4-葡聚糖甘内切酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶，在前两种酶的作用下生成纤维二糖，纤维二糖最终在β-葡萄糖苷酶的作用下水解成葡萄糖[2]。纤维二糖和纤维寡糖是纤维素酶系的抑制剂，为了解除其抑制作用，其中的β-葡萄糖苷酶活性成为纤维素高效降解的关键因素。虽然β-葡萄糖苷酶也受到自身产物葡萄糖的抑制，但可以通过控制糖化和发酵过程解决[3]。β-葡萄糖苷酶对纤维素糖化水解具有关键性作用，但微生物所产纤维素酶系中β-葡萄糖苷酶所占比例不足1%，这使得β-葡萄糖苷酶成为纤维素降解成单糖的关键因素[4]，工业上通过往纤维素酶水解系统中添加β-葡萄糖苷酶来提高纤维的水解效率[5]。

微生物中β-葡萄糖苷酶酶活高的菌种主要是霉菌，A.niger是优良的产β-葡萄糖苷酶的菌，国内目前对β-葡萄糖苷酶的研究还主要在β-葡萄糖苷酶的生产菌种选育和在大肠杆菌中表达，产酶水平低，难以提取纯化[6-7]。酵母表达系统兼有大肠杆菌表达系统的优势：便于培养，基因操作，成本低，繁殖快，又可对真核基因产物进行翻译后加工，得到有活性的蛋白质。其中选用表达载体pPIC9K含有分泌型信号肽，利于胞外表达。通过抗生素浓度梯度筛选得到高拷贝数的基因整合到染色体DNA上，在提高表达量的基础上也保证后代的遗传稳定性。唐德芳[8]在筛选出一株黑曲霉的基础上，进一步构建酵母工程菌，经诱导表达，β-葡萄糖苷酶比活力达7.85 U/mg，但未报导其发酵产酶水平。陈士华[9]采用pPICZaA载体构建的重组菌在诱导培养72 h后，发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL，还不能满足工业化生产要求。为进一步提高产酶水平，作者拟构建酵母工程，实现高效分泌表达β-葡萄糖苷酶，为解决β-葡萄糖苷酶产量低、成本高等问题提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 菌种和质粒

黑曲霉（Aspergillus niger）：购自工业微生物菌种保藏中心；毕赤酵母Pichia pastoris GS115、大肠杆 菌 E.coli JM109、BL21、pMD-18T 和 pPIC9K 载体：均购自美国invitrogen公司。

1.2 培养基与主要试剂

pfu DNA聚合酶、T4DNA连接酶、M-MLV逆转录酶试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、RNA 提取试剂盒、pNPG、DNA marker、G418、琼脂糖、氨苄青霉素、IPTG、X-gal：均购自上海生工；各种限制性内切酶：购自 NEB公司；LB、YPD、BMGY、BMMY培养基：参照Invitrogen公司产品使用手册。

1.3 方法

1.3.1 基因克隆 将黑曲霉样品液氮速冻后立即研磨，用Trizol试剂提取总RNA，反转录后进行PCR 扩增，步骤如下：将 50 μL 体系的反应液（3 μg RNA，1 μL oligodT）65 ℃变性 5 min， 冰上冷却 5 min。 再加入 5 μL 10×buffer， 1 μL M-MLV 逆转录酶，0.5 μL逆转录酶抑制剂，37℃反应1 h，70℃变性10 min。根据NCBI数据库中Aspergillus niger的bgl基因序列（GI:159034137），采用 Premier5 软件设计 引 物 ：Primer1:5-CGGTAC GATGAGGTTCA CTTTGATCGA-3;primer2：5′-CGGCGGCCGCTTAG TGAACAGTAGGCA GAG-3′。

PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性1 min，58℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，25个循环，PCR产物割胶回收，克隆到pMD-18T载体，构建pMD-18T-bgl，转化 E.coli Jm109，在含有氨苄抗性的LB平板挑转化子，送上海生工测序。

1.3.2 重组表达载体pPIC9K-bgl的构建 用SnaBⅠ和 NotⅠ分别双酶切pMD-18T-bgl和空载体pPIC9K，胶回收纯化后于16℃连接过夜，转化E.coli JM109，在含有氨苄（50 μg/mL）抗性的 LB 平板挑转化子，提取重组质粒酶切验证，阳性克隆即pPIC9K-bgl。

1.3.3 毕赤酵母电击转化、筛选 用BglII线性化重组质粒pPIC9K-bgl，电转化100 μL感受态毕赤酵母细胞，对照为BglII线性化pPIC9K空载体，使用MD培养基和MM培养基对转化子进行初筛，30℃培养至长出单菌落。为获得多拷贝bgl基因的菌株，挑取阳性转化子接种于YPD/G418平板上，30℃培养至长出单菌落，G418质量浓度梯度依次为0.5、1、2、4 mg/mL，最后采用PCR扩增进行验证。

1.3.4 重组毕赤酵母的培养 将鉴定的阳性克隆单菌落接种至10 mL YPD培养基，30℃培养24 h，1 mL培养液接入50 mL BMGY，30℃培养24 h，离心收集菌体，用25 mL BMMY培养基重悬培养，1%甲醇诱导表达。分别于 24、48、72、96、120 h 取样，离心收集上清液，用 25 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）缓冲液在透析袋中过夜透析后测定酶活性。

1.3.5 重组β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE 将重组毕赤酵母诱导培养于50 mL的YPD培养基中，30℃、200 r/min培养72 h。发酵液于4℃离心，8 000 r/min 离心 4 min，取上清液 40 μL 于 10 μL 5×上样缓冲液混合均匀，水中煮沸2 min，取 20 μL进行SDS-PAGE。

1.3.6 温度和pH值对重组β-葡萄糖苷酶的影响将重组β-葡萄糖苷酶酶液在不同pH缓冲液中（pH 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）50 ℃保温 30 min；在不同温度下 （30、40、50、60、70、80 ℃） 保温 30 min后加入100 μL三氯乙酸终止反应，检测酶活力。

1.3.7 β-葡萄糖苷酶酶活测定 pNPG为底物测定β-葡萄糖苷酶活性，最适反应条件下每分钟催化底物水解产生1 μmol对硝基苯酚的酶量为1 U[10]。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取及RT-PCR结果

将提取的总RNA上琼脂糖凝胶电泳检测 （图1A）， 可以看到 rRNA 清晰的 3 条带：28S，18S，5S，RNA样品的OD260/OD280比值在2.0左右，RNA质量较好，能满足RT-PCR实验要求。使用目的基因特异性引物，进行RT-PCR，得到2.5 kb左右的一条DNA 条带（图 1B）。

2.2 pMD-18T-bgl重组子筛选与检测

重组质粒pMD-18T-bgl转化到感受态E.coli JM109后用蓝白斑的方法进行筛选，随机挑取3个白斑培养，提取质粒电泳检测，见图2。根据相对分子质量的大小，其中有2个可能是阳性克隆子。将这2种质粒进行PCR验证，得到了约2.5 kb左右的条带，与目的基因条带一致，初步表明RT-PCR产物TA克隆成功。测序结果表明：该基因的cDNA阅读框2583 bp，将cDNA序列在NCBI数据库中进行Blast比对分析。通过同源性比较可知，该cDNA与GenBank中已公布的黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88 β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性高达99%[11]，证明该cDNA全序列是黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因。

图1 总RNA电泳图片（A）和 RT-PCR产物电泳图（B）Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from Aspergillus niger（A）and RT-PCR production of bgl gene（B）

图2 重组质粒PCR验证结果Fig.2 PCR production of pMD-18T-bgl plasmid

2.3 pPIC9K-bgl分泌表达载体的构建

用SnaBⅠ和NotⅠ分别双酶切pMD18-T-bgl和pPIC9K表达载体，连接后转化大肠杆菌E.coli JM109。筛选氨苄抗性的重组克隆提取质粒，用SnaBⅠ和NotⅠ双酶切验证重组克隆中含有β-葡萄糖苷酶基因bgl，结果见图3。重组表达质粒pPIC9K-bgl可以用于毕赤酵母的转化。

2.4 毕赤酵母转化子的筛选与PCR验证

通过G418抗菌素平板上筛选出的阳性重组子，在MD、MM平板上，30℃培养观察其生长情况。选择其中表型为His+Muts进行进一步验证和酶活测定分析。挑取3个阳性克隆至YPD培养基中，30℃、150 r/min，培养36 h，提取基因组DNA，以primer1和primer2为引物进行PCR，电泳结果见图4。阳性转化子均含有β-葡萄糖苷酶基因片段。

图3 SnaBⅠ和NotⅠ双酶切验证重组质粒pPIC9K-bglFig.3 Restriction analysis of recombinant plasmid pPIC9K-bgl

图4 重组表达载体PCR产物Fig.4 PCR production of pPIC9k-bgl plasmid from P.pastoris GS115

2.5 表达产物的SDS-PAGE分析

酵母转化子经甲醇诱导培养后，上清液进行SDS-PAGE。图5聚丙烯酰胺凝胶电泳图表明，β-葡萄糖苷酶基因在毕赤酵母GS115中得到表达，重组子诱导培养后，上清液SDS-PAGE上出现明显的条带，对照菌株毕赤酵母（pPIC9K）无此条带。

图5 表达产物的SDS-PAGE电泳图Fig.5 SDS-PAGE of expressing product

2.6 不同发酵时间内重组β-葡萄糖苷酶的酶活

挑选酶活最高的重组酵母再进行诱导培养，每隔24 h测定一次酶活，其产酶曲线见图6。可以看出，其β-葡萄糖苷酶酶活在连续诱导的前72小时一直呈增长趋势，72 h以后便不再增长，呈缓慢下降趋势。

图6 P.pastoris GS115 β-葡萄糖苷酶酶活测定曲线Fig.6 Curve of P.pastoris GS115 β-glucosidase activity

2.7 温度和pH值对重组β-葡萄糖苷酶的影响

将重组酵母诱导培养72 h后，在不同pH值反应条件下测得酶活力。以pH值为横坐标，酶活力为纵坐标，作出pH曲线，见图7。从图7可以看出，β-葡萄糖苷酶的最适pH为5.5。在pH 4.0～7.0的范围内，β-葡萄糖苷酶均有活性。在最适pH值条件下，分别在30～80℃温度条件下测定重组β-葡萄糖苷酶的活力，该酶最适反应温度为50℃，在30～70℃之间均有酶活性。

图7 温度和pH值对重组β-葡萄糖苷酶的影响Fig.7 Effect of temperature and pH on the activity of recombinant β-glucosidase

3 结语

β-葡萄糖苷酶在医药、食品、饲料、造纸、印染、纺织、石油开采及生物技术研究等多方面得到了广泛的应用，构建的工程酵母来高效表达β-葡萄糖苷酶，以解决目前β-葡萄糖苷酶产量低、成本高等问题。由于酿酒酵母细胞膜上缺少通透酶，使得纤维二糖不能进入胞内，因此需使编码β-葡萄糖苷酶的外源基因带有信号肽能够被分泌到胞外，从而增加工程酵母菌株降解纤维素的能力，以便更好利用纤维素及纤维二糖来生产乙醇，为纤维素高效降解、生产燃料乙醇提供有效的解决途径。采用RT-PCR技术成功扩增出β-葡萄糖苷酶全长基因bgl，构建克隆载体pMD-18T-bgl。测序结果表明：bgl全长2 583 bp，可编码一个860个氨基酸的蛋白质，与β-葡萄糖苷酶基因（XM001398779.1）核苷酸序列同源性为99%，氨基酸序列同源性为99%，属于β-葡萄糖苷。将重组pMD-18T-bgl中的bgl插入酵母分泌表达载体pPIC9K中，构建了表达载体pPIC9K-bgl，成功实现在Pichia pastoris GS115高效表达，获得与预期大小相一致的重组蛋白质。陈士华采用pPICZaA载体构建的重组菌在诱导培养72 h后，发酵液的酶活力可达到0.78 U/mL。作者所构建的工程菌发酵上清液中β-葡萄糖苷酶的最高酶活达到38 U/mL，提高近50倍。发酵上清液中蛋白质主要是酶蛋白，杂蛋白质较少，后续的分离纯化过程就相对简单，分离步骤较少，为后续的发酵放大提供实验依据。

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