一株桑沟湾赤潮藻的分子鉴定

徐 娜,逄少军,刘 峰

(1.中国科学院 海洋研究所,山东 青岛 266071;2.中国科学院 研究生院,北京 100049)

桑沟湾位于山东半岛最东端,是一个面向黄海的半封闭型海湾,水域广阔,是北方重要的海珍品和大型藻类养殖基地。2011年5月开始,桑沟湾养殖区暴发较大规模赤潮,一直持续到 8月上旬台风“梅花”来袭才完全消亡。赤潮高密度暴发区海水呈黄棕色,透明度明显下降。赤潮使养殖区的鲍鱼摄食大大减少。据当地养殖户描述这种大规模赤潮在桑沟湾历史上非常少见。桑沟湾养殖区环境质量优良,目前还没有关于桑沟湾暴发赤潮的文献记载。这次罕见的赤潮对桑沟湾环境及养殖业都造成了较大影响。作者采集了赤潮暴发区的海水,分离得到了一株优势种赤潮藻并对其进行了鉴定。

赤潮藻类个体微小,传统的鉴定主要通过在显微镜下观察其形态学特征,这需要鉴定人员有丰富的经验。此外一些有害赤潮藻种和无害物种形态相似,光学显微镜下难以分辨,需要电子显微镜下的细节观察[1],而电镜观察需要设备条件及熟练的样品处理能力。因此传统的形态学鉴定方法受到一定的限制。基于DNA分子序列对物种的鉴定是一种简单、准确而高效的分析方法,GenBank数据库中也收录了越来越多可供比对的分子序列,其中大部分信息较为可靠,因此非专业的藻类分类工作者易于通过分子序列完成对微藻的鉴定。18S rDNA和ITS序列是藻类分子鉴定和分类中最常用的分子指标[2]。本研究分离得到的赤潮藻在光学显微镜观察下初步判断为裸甲藻类似种,由于藻细胞固定时易变形,且电镜观察条件暂难满足,因此作者以 18S rDNA和ITS分子序列为依据鉴定这株藻。

1 材料与方法

1.1 水样的采集和种质的分离培养

2011年6月于桑沟湾养殖区赤潮发生水域(37.14N,122.55E)采集水样 1L,装入洁净的聚乙烯塑料瓶置于低温环境下带回实验室。水样加入灭菌海水配制的f/2培养液[3-4](不添加硅酸盐),在依据采集地环境设定的条件下进行富集培养。对观察到的优势藻在显微镜下进行藻种分离纯化。定期观察,得到纯的藻种后扩大培养。培养温度为 20℃,以白炽灯为光源,光照强度为 5 000 lx,光照周期控制在12L：12D。

1.2 分子鉴定

取50 mL处于对数生长期的纯种藻液,7 000g离心5 min,弃上清收集藻细胞。用试剂盒提取基因组 DNA。18S rDNA序列的扩增采用真核生物 18S通用引物SSU-F/ SSU-R[5]。扩增ITS序列(包括ITS1、5.8S rDNA 和ITS2)的引物为 ITS1/ ITS2[2]。PCR反应体积50 μL,体系包括：模板基因组DNA 2.5 μL,引物(20 μmol/L)各 1.25μL,Taq酶预混合的 PCR反应液 25 μL,ddH2O 20 μL。18S 序列扩增循环程序为：94℃预变性10 min;之后94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸90 s,循环32次;最后72℃延伸10 min[5]。ITS序列扩增程序为：95℃预变性5 min;之后94℃1 min,55℃ 1 min,72℃ 2 min,循环 30次,最后72℃延伸5 min[2]。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段,连接到 pMD19-T载体,并转化感受态Escherichia coliDH-5α,用蓝白斑法筛选阳性克隆。用菌液 PCR检测白斑菌落,重组成功的菌落扩增培养后送至上海博尚测序公司测序。

将测得的序列在 NCBI用 BLAST (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源检测,找出与其最相近的物种。在Genbank下载其他相关物种的18S rDNA序列及ITS序列,与该藻株的序列一起用BioEdit软件的Clustal W[6]程序进行多序列对位分析。后用MEGA 4[7]的 Kimura 2-parameter 模型计算遗传距离,采用邻接法(neighbor-joining/NJ)[8]构建系统进化树,用自展检验(bootstrap)[9]估计系统树分支节点的置信度,自举数据集为1000次。

2 结果与分析

2.1 形态学特点

分离纯化得到的这株藻记录为 SGW201106-1。生长状态良好的藻液呈黄褐色。在显微镜下观察,活跃的游动细胞长 10～15 μm,宽7～12 μm,游动较迅速。细胞横沟明显,将细胞分为基本同样大小的上下两部分(图1)。鞭毛两条,一条从细胞基部伸出,另一条从中间的横沟处伸出。加入固定液后,细胞容易变形。根据形态特点初步判断这株藻为裸甲藻类似种。

图1 甲藻SGW201106-1的形态特征Fig.1 Light microscopic photos of strain SGW201106-1

2.2 基因序列分析

2.2.1 18S rDNA序列

经 PCR扩增后测序得到的藻株 SGW201106-1的 18S rDNA序列长度为 1 783 bp,将序列提交GenBank,得到序列索引号为JN986577。

将此18S rDNA序列经BLASTn搜索,与之比对得分最高的是卡罗藻K.micrum(=K.veneficum,见下文讨论部分),并与 GenBank中收录的 11条K.micrum18S rDNA序列的最大相似性都为99%。用MEGA 4以邻接法(NJ)构建的18S rDNA系统进化树见图2,建树所用的外类群为甲藻门塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)。图2表明,SGW201106-1与11株K.micrum和1株K.veneficum聚为一支,再与同为凯伦藻科(Kareniaceae)的达卡藻属(Takayama)聚在一起,与同科的凯伦藻属(Karenia)亲缘关系相对稍远。

经Clustal W对位分析比较,SGW201106-1的18S rDNA与索引号为EF492506的K.micrum只在1 783 bp序列的第343个位点有一个碱基替换的差异。

2.2.2 ITS序列

PCR扩增后获得SGW201106-1的ITS序列长度为687 bp,去除两端多余rDNA序列后实际长595 bp,其中ITS1为218 bp,中间5.8S rDNA 159 bp,ITS2序列 218 bp,后提交至 GenBank获得序列索引号JN986578。

ITS序列经BLASTn搜索,与之比对得分最高的前17条序列都是K.micrum和K.veneficum,与之相似性都高于97%,最高为100%。依据ITS序列构建的系统进化树(图3)中,SGW201106-1与GenBank中的11株K.micrum和6株K.veneficum完全聚在一起,支持率99%,后与Karlodinium属另一种K.armiger聚为一支。这一支与同为 Kareniaceae科的Takayama属聚在一起,最后再与同科的另一属Karenia聚合。

经 Clustal W 对位分析比较,SGW201106-1的ITS序列与GenBank索引号为AJ557026的K.micrum只在595 bp的序列中第415、416位点有两个碱基插入的差异,位于ITS2区。

图2 依据18S rDNA序列通过邻接法构建的系统树(重复1000次计算bootstrap值),以Alexandrium tamarense为外类群Fig.2 The neighbor-joining tree of 18S rDNA sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

以上结果表明,SGW201106-1的18S rDNA和ITS序列与GenBank中的K.veneficum/ K.micrum非常接近,而K.micrum与K.veneficum是同种异名,已被修订为K.veneficum[10]。因此,本文中在桑沟湾赤潮水样中的分离得到的这株优势种甲藻为卡罗藻Karlodinium veneficum,属于裸甲藻目(Gymnodiniales),凯伦藻科(Kareniaceae),卡罗藻属(Karlodinium)。

3 讨论

K.veneficum是一种常见的赤潮甲藻,它的分类名称曾有多种,后经研究证实有几种与它相近的甲藻都是同种异名。Daugbjerg等[11]将Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum都修正为K.micrum,并认为与K.veneficum是同属不同种。而Bergholtz等[10]则通过形态学比较和核糖体大亚基基因(LSU rDNA)分析,认为K.micrum与K.veneficum是同一种,将K.micrum修正为K.veneficum。Garcés等[12]的研究也表明K.micrum与K.veneficum的色素组成一致,支持Bergholtz的结论,认为二者应该为同一种。目前大多研究人员已接受K.micrum与K.veneficum为同一种的说法[13-18]。因此过去所有报道中用到的名称(包括Gymnodinium galatheanum,Gymnodinium micrum,Gyrodinium galatheanum,Karlodinium micrum,Karlodinium galatheanum,Gymnodinium veneficum)都应当修正为K.veneficum。K.veneficum之前广被接受的中文译名是微小卡罗藻,由K.micrum翻译而来,修正为K.veneficum后,国内有一篇中文文章将其译为剧毒卡尔藻[19]。

K.veneficum属于裸甲藻目(Gymnodiniales),是一种世界广布性的赤潮甲藻且能产生卡罗藻毒素[20-21],曾被报道在欧洲、非洲和北美洲等很多地方引起赤潮并导致鱼类死亡[22]。在中国,关于K.ve-neficum引发赤潮的正式报道较少,其曾在中国香港海域发生过赤潮,但没有相关鱼类死亡的报道[23-24]。另有文章提到2005年6月K.veneficum与其他藻一起在洞头东海海域引发赤潮,但其不是主要优势种;2007年6月,K.veneficum在象山湾的一个虾池中大量暴发[25]。

图3 依据ITS序列通过邻接法构建的系统树(重复1000次计算bootstrap值),以Alexandrium tamarense为外类群Fig.3 The neighbor-joining tree of ITS sequences.Bootstrap values (%) of 1000 replicates are given adjacent to each node.Alexandrium tamarense is used as outgroup

桑沟湾是中国北方地区历史悠久的水产养殖湾之一,其养殖区环境优良[26],大型海藻海带养殖规模很大,其中也夹杂着部分牡蛎、扇贝以及鲍鱼的筏式混养。桑沟湾被认为是海水水产动物和植物养殖搭配合理的典范。因此其水质中营养盐基本保持平衡,多年来鲜有大面积赤潮发生。2011年5月份的这次赤潮规模在桑沟湾历史上比较罕见。另外,先前科研人员对桑沟湾浮游植物优势种调查结果中都没有发现卡罗藻K.veneficum[27-29]。因此不排除K.veneficum来自桑沟湾以外水域环境的可能。鲍鱼和龙须菜在我国福建养殖区和桑沟湾的季节性互移养殖[30-31]都有可能将新的物种从南方水域带入桑沟湾。K.veneficum在桑沟湾被发现是否属于这种情况需要进一步的数据支持。桑沟湾有丰富的营养物质基础及适宜的环境条件,外来种一旦遇到这些适宜的条件,容易暴发性增长。桑沟湾海区溶解无机氮和活性磷酸盐的浓度在夏秋季高于春冬季,夏秋季陆源丰水期河流径流水携带大量的工农业废水和城市生活污水中所含氮、磷化合物进入该湾[32],而 5、6月份湾内养殖的大量海带、裙带菜等大型藻类多已采收完毕,对海水中营养盐的消耗减少,因此此时的高营养水平是赤潮暴发的物质基础。另外此时恰逢高水温期,风力小,为赤潮暴发和蔓延提供了最适宜的条件。赤潮暴发后,对当地的养殖业带来较大影响,本项研究的结果将为今后桑沟湾海区环境监测和赤潮预防提供有价值的信息。

致谢：感谢山东荣成市蜊江水产有限责任公司的工作人员在水样采集中给予的帮助。

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