黄瓜L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶cDNA全长的克隆和遗传转化

苑志明，劳杉杉，秦智伟，周秀艳

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

维生素C别名抗坏血酸（Ascorbic acid，AsA），是藻类、高等植物和大多数动物体内合成的一种己糖内酯化合物。抗坏血酸可以清除生物体内代谢产生的活性氧（Reactive oxidative species，ROS），一定浓度的ROS是生物体内必须的，但ROS浓度过高会造成细胞损伤，引起生物衰老和死亡，逆境会造成植物体内ROS升高[1]。高等植物抗坏血酸合成的L-半乳糖途径中，L-半乳糖-1，4内酯由GalLDH直接氧化成抗坏血酸，GalLDH是抗坏血酸合成过程中的关键酶之一[2]。

由于人体内缺乏抗坏血酸合成过程中的关键酶，只能从食物中摄取[3]。因此，园艺产品中的AsA含量已成为衡量品质的重要指标。黄瓜中抗坏血酸含量较低，到目前为止没有研究能解释这种现象。本试验通过克隆黄瓜中抗坏血酸合成的关键酶GalLDH，为今后研究黄瓜中抗坏血酸含量较低的原因，改良黄瓜的营养品质奠定一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为黄瓜D08108果肉，由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提供。雌花自然开花后10 d采样，将果肉切成薄片用锡纸包好，并用液氮速冻后存于-80℃冰箱，用于提取RNA。将幼嫩的番茄（HN11）叶片称取0.2 g用锡纸包好，并用液氮速冻后存于-80℃冰箱，用于提取DNA。番茄品种由东北农业大学园艺学院提供。

载体pBI121和农杆菌由东北农业大学园艺学院实验室提供。黄瓜组织培养外植体选用栽培品种649，由东北农业大学园艺学院黄瓜课题组提供。

1.2 应用RT-PCR克隆黄瓜GalLDH

1.2.1 总RNA的提取和逆转录

称取0.5 g果肉用Trizol法提取RNA，用SMA3000分光光度计检测，用于逆转录合成cDNA。选用Fermentas逆转录试剂盒，取2 μL RNA用于逆转录，取3 μL逆转录产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA质量。

1.2.2 RT-PCR

根据GenBank中登录的甜瓜GalLDH（AF252339.2）的基因序列设计引物，SGalLDH：5'GTTGGGG AATCATAAACC 3'和AGalLDH：5'AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。以逆转录的cDNA为模板，用SGalLDH和AGalLDH进行PCR，反应条件为：94℃5 min预变性后，94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，循环35次，最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物回收与测序

将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳30 min，百泰克多功能小量DNA回收试剂盒进行胶回收，连接到pEASY-T3载体（全式金）上，然后转化到大肠杆菌DH5α菌株中，并涂在含有50 mg·mL-1Amp+、IPTG和X-gal的LB平板上，挑选白色菌落，放入含有Amp+的5 mL液体LB培养基中，37℃条件下，200 r·min-1，过夜。百泰克质粒小量回收试剂盒提取质粒，Fermentas快速内切酶Eco RⅠ37℃酶切5 min，用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的片段。由上海英骏生物技术有限公司完成测序。

1.3 2A12果实特异性启动子的克隆

CTAB法提取番茄幼嫩叶片DNA，扩增2A12基因的引物序列为S2A12：5'AGCACTTGTTAGA CTCATCTG 3'和 A2A12：5'AATGGTTTTGGATTA ATTGC 3'，以番茄DNA为模板进行PCR扩增。

1.4 酶切位点的添加

在S2A12添加HindⅢ位点即M-S2A12：5'GT CAAGCTTAGCACTTGTTAGACTCATCT 3'，在A2A12上添加XbaⅠ位点即M-A2A12：5'GTATCTAGAAA TGGTTTTGGATTAATTGC 3'。在SGalLDH上添加XbaⅠ位点即M-SGalLDH:5'GTCTCTAGAGTTGGG GAATCATAAACC 3'，在AGalLDH上添加SmaⅠ位点即M-AGalLDH:5'GATCCCGGG AAACACTTATC CAACTGGACAAC 3'。

1.5 表达载体的构建和检测

对含有GalLDH目的片段（已添加酶切位点）的pEASY-T3载体和pBI121分别用Fermentas快速内切酶XbaⅠ和SmaⅠ进行双酶切，进行胶回收，然后用Fermentas T4连接酶进行连接；将连接好的中间载体和含有2A12基因（已添加酶切位点）的pEASY-T3载体分别用Fermentas快速内切酶HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，进行胶回收，然后用Fermentas T4连接酶进行连接，将连接好的载体转入农杆菌中。用CTAB法提取黄瓜总DNA。

1.6 黄瓜GalLDH的cDNA生物学分析

采用Primer premier 5.0软件进行引物设计，由ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析开放阅读框；采用ExPASy的ProtParam Tool（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）分析编码氨基酸理化性质；应用TreeView和CLUSTALX进行序列比对和进化树构建分析。

2 结果与分析

2.1RNA的质量、黄瓜GalLDH的RT-PCR扩增

提取黄瓜D08108果肉的总RNA，用SMA3000分光光度计检测，OD260/280≈1.8，3015 ng·μL-1，取3 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量见图1（A），以逆转录的cDNA为模板进行RT-PCR扩增，获得一条1880 bp的特异性条带见图1（B）。

图1 黄瓜果实总RNA（A）及GalLDH基因的RT-PCR扩增（B）Fig.1 Total RNA(A)and RT-PCR product of GalLDH(B)from fruit of cucumber cultivar D08108

2.2 黄瓜GalLDH的生物学分析

黄瓜GalLDH经测序是一个全长为1880 bp cDNA序列，包含一个长为1773 bp的完整开放阅读框，在5'端有47 bp的非编码序列，在3'端有60 bp的非编码序列。其GenBank登录号：HQ446099，碱基序列及推导的氨基酸序列如图2所示，通过与GenBank中登录的同源基因进行核苷酸相似度比较，黄瓜GalLDH与甜瓜相似度最高，为96%，与猕猴桃相似度为76%，与其他物种相似度均在70%以上。

图2 植物GalLDH基因氨基酸序列系统树分析Fig.2 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of plant GalLDH gene

黄瓜GalLDH氨基酸序列的分子质量为67297.2，理论等电点9.04，氨基酸数590，亲水性平均值-0.475，不稳定指数48.30，为不稳定蛋白质。

2.3 表达载体构建的检测

对构建好的载体进行用SGalLDH：5'GTTGGG GAATCATAAACC 3'和 AGalLDH：5'AAACACTTAT CCAACTGGACAAC 3'、S2A12：5'AGCACTTGTTA GACTCATCTG 3'和A2A12：5'AATGGTTTTGGATT AATTGC 3'进行PCR检测，得到一条1880 bp的目的条带和一条850 bp的目的条带（见图3）。

图3 重组质粒的PCR鉴定Fig.3 Detection of recombinant plasmid by PCR

2.4 转基因黄瓜的检测

选用2A12启动子的特异引物对转基因黄瓜进行检测，共得到13株再生植株，其中转基因植株5株。转基因阳性植株扩增条带与预期一致，阴性植株没有扩增出条带，第1道是构建载体，第2道是阴性对照，3～7道是扩增出的阳性条带（见图4）。组培图片中A是子叶节，B是组培苗，C是组培苗的生根过程，D是驯化中的组培苗（见图5）。

图4 转基因黄瓜植株的PCR检测Fig.4 Detection of transgenic Cucumis sativus by PCR

图5 黄瓜组培Fig.5 Cucumber tissue culture

3 讨论与结论

抗坏血酸含量的高低是衡量园艺产品品质的重要指标之一[4]，抗坏血酸在光合作用和光合保护中起重要作用[5-6]。抗坏血酸还可以作为一系列重要酶反应的辅因子[3]，抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的相对比率影响植物的细胞分裂[7]。高等植物抗坏血酸的合成主要是通过L-半乳糖途径，但是也不排除其他途径的可能[8]。本试验中克隆的GalLDH在高等植物中普遍存在。目前造成黄瓜抗坏血酸含量低的原因并不明确，因为抗坏血酸参与植物体内大量的代谢活动，一直处在一个动态平衡的条件下。因此通过黄瓜GalLDH的克隆，为黄瓜中抗坏血酸含量的研究奠定基础，为今后黄瓜抗坏血酸的研究起到辅助作用。不足之处，由于试验使用的是果实特异启动子，组培苗并未结瓜，所以无法检测其抗坏血酸的含量变化。

[1] Agius F,Lamothe R G,Caballero J L V.Engineering increased vitamin C levels in plants by over expression of a D-galacturonic acid reductase[J].Nature Biotechlonogy,2003,21:177-181.

[2] Dvaey M D,Van Montaug M,Inze D,et al.Plnat L-ascorbic aeid:chemistry,function,metabolism,bioavailability,and effects of processing[J].J Sci Food Agr,2000,80:825-860.

[3] 赵丽华,裘娟萍,黄敏,等.抗坏血酸糖类衍生物的研究进展[J].饲料工业,2002,25(2):28-30.

[4] Eskling M,Avridsson P O,Akerlund H E.The xanthophylls cycle,its regulation and components[J].Physiol Palnt,1997,100:806-816.

[5] Potters G,Nele H,Roland J C.Asorbate and dehydroaseorbate influence cell cycle progression in a tobacco cell suspension[J].Plant Physiol,2000,11(24):17-20.

[6] 曲丽,秦智伟.黄瓜白粉病病原菌及抗病性研究进展[J].东北农业大学学报,2007,38(6):835-841.

[7] 石延霞,李宝聚,刘学敏.黄瓜霜霉病研究进展[J].东北农业大学学报,2002,33(4):391-395.

[8] Wheeler G L,Jones M A,Smimoff N.The biosynthetic pathway of vitamin C in higher plants[J].Nature,1998,393:365-369.

[9] Wnag W,Vinocur B,Altmna A.Plant responses to doruhgt,salniity and extreme temperatures:Towards genetic cngineering for stress tolerance[J].Planta,2003,218:1-14.

[10] Yabuta Y,Motoki T,Yoshimura K.Thylakoid membrane-bound ascorbate peroxidase is a limiting factor of antioxidative systems under photo-oxidative stress[J].Plant J,2002,32:915-925.

[11] 张鹏,秦智伟.黄瓜耐热性遗传分析[J].东北农业大学学报,2007,38(4):486-490.