长期联合应用噻吗洛尔对结膜组织炎性标记物ICAM-1和HLA-DR表达的影响△

彭 坤 靳 隽 杨玉新 许银霞 王保君 闫义涛 杨 华

青光眼治疗首选仍是降眼压药物，有些患者需要长期甚至终身使用，长期用药带来的毒性作用也日益得到关注。研究表明，长期应用抗青光眼药物能引起眼表组织损伤，如结膜炎症、浅层点状角膜炎、泪液分泌减少、泪膜破裂时间缩短等，术前长期抗青光眼药物治疗是滤过性手术失败的危险因素之一。发生这些改变的机制主要是药物和其赋形剂引起的过敏反应、毒性作用及慢性炎症［1］。本研究采用免疫组织化学方法，观察噻吗洛尔单一用药及联合用药时不同时相炎性标记物细胞间黏附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)和人类白细胞抗原-DR(human leukocyte antigen-DR，HLADR)在结膜组织中的表达情况，为明确长期应用抗青光眼药物的毒性作用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 TS-12J生物自动脱水机(湖北孝感诺普电子科技有限责任公司)，Leica SM2400切片机、Leica Hi展片机(德国Leica公司)，FA1104电子天平及台式高速离心机(上海升隆电子天平公司)，WD800TL23-K3微波炉(广州格兰仕集团有限公司)，新飞组合变温型冰箱BCP-205(河南新飞电器有限公司)，电热恒温水温箱(上海沪粤明科学仪器有限公司)，显微镜和直立光照照像系统(日本O-lympus株氏会社)。兔抗人ICAM-1单克隆抗体、兔抗人HLA-DR单克隆抗体、即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、TDAB染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.2 研究对象 从我科收住的患者中随机选择40岁以上原发性开角型青光眼患者90例，所有患者均无糖尿病、肾病及风湿病史，局部及全身未用过糖皮质激素，裂隙灯下检查球结膜无微血管瘤、角膜缘无新生血管和眼部无炎症。根据抗青光眼药物治疗的种类分为3组:应用2种青光眼药物治疗(5 g·L-1噻吗洛尔与2 g·L-1阿法根)即联合用药组30例，1种抗青光眼药物治疗(5 g·L-1噻吗洛尔)即单一用药组30例，无抗青光眼药物治疗即未用药组30例。另选择单纯白内障患者30例作为空白对照组，眼部满足条件同原发性开角型青光眼患者。各组按抗青光眼药物治疗时间及白内障患病时间又分为3个时相(0～6个月、7～12个月、13～18个月)组，每组10例。参与实验的患者已知情并同意，并且通过本院伦理委员会批准。

1.3 标本收集 90例青光眼球结膜标本均为小梁切除术时在位于角膜缘鼻上方11∶00～1∶00点钟位、以最小创伤剪除的2 mm×2 mm球结膜组织，30例白内障球结膜标本为晶状体植入术时切除的2 mm×2 mm球结膜组织，每次切除的球结膜组织立即放于装有5 mL福尔马林、酒精、冰醋酸混合固定液的小瓶中，常温下固定，固定时间至少24 h，最多不超过半年，所有标本常温下保存。

1.4 免疫组织化学染色 球结膜组织于体积分数10%中性甲醛中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3 μm厚度切片，常规脱蜡至水。蒸馏水洗2 min×3次，体积分数3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，室温30 min，蒸馏水洗2 min×3次。切片置于0.01 mol·L-1柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)内，微波炉内加热使温度保持在92～98℃之间并保持10～15 min，室温冷却20 min，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加50 g·L-1BSA封闭液，37℃ 30 min，甩去多余液体，不洗。兔抗人ICAM-1单克隆抗体(1∶100)、兔抗人HLA-DR单克隆抗体(1∶100)作为一抗，4℃孵育过夜，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加生物素化山羊抗兔IgG作为二抗，37℃ 20 min，0.02 mol·L-1PBS洗3 min×3次。滴加试剂SABC，37℃ 20 min，0.02 mol·L-1PBS洗5 min×4次。DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。整个实验过程中，用PBS代替一抗作空白对照。光镜下ICAM-1和HLADR阳性表达表现为细胞膜或细胞核呈棕黄色或棕褐色。在400倍镜下随机选择10个不重叠的视野，每张标本连续选择4张切片，分别计数每个视野下ICAM-1和HLA-DR阳性细胞数，计算其平均值。

1.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行分析，数据均采用均数±标准差(s)表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较采用两组独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结膜组织中ICAM-1免疫组织化学染色结果空白对照组与未用药组结膜组织中ICAM-1阳性细胞数各时相均维持在较低水平，差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见图1-图2)。抗青光眼药物作用0～6个月、7～12个月时，单一用药组、联合用药组及未用药组和空白对照组比较，ICAM-1阳性细胞均无明显增多，差异均无统计学意义(均为 P＞0.05，见图3-图6);抗青光眼药物作用13～18个月时，单一用药组及联合用药组ICAM-1阳性细胞数较空白对照组明显增多，差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01)，且联合用药组增加更明显。单一用药组及联合用药组在13～18个月时ICAM-1阳性细胞数较0～6个月、7～12个月明显增多，差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01，见图7-图8、表1)。

表1 各组结膜组织中不同时相ICAM-1阳性细胞数比较Table 1 Comparison of ICAM-1 positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

Note:Compared with former time point in the same group，*P＜0.01;Compared with control group at the same time，△P＜0.01

Group n 0-6 months 7-12 months 13-18 months Combined therapy 30 6.27±1.39 7.07±1.32 32.61±1.53＊△Single treatment 30 6.21±1.45 6.89±1.31 22.59±1.85＊△Non-drug 30 5.74±0.97 5.43±1.34 5.38±2.31 Control 30 4.98±1.65 5.45±1.73 5.12±1.14

2.2 结膜组织中HLA-DR免疫组织化学染色结果

空白对照组与未用药组结膜组织中HLA-DR阳性细胞数各时相均维持在较低水平，差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见图9-图10)。单一用药组与联合用药组在0～6个月、7～12个月时结膜组织中HLA-DR阳性细胞数与空白对照组比较，差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见图11-图14)，但在13～18个月时阳性细胞数达到最高，与前两个时间点相比差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01);单一用药组及联合用药组13～18个月时HLA-DR阳性细均胞数较1～6个月、7～12个月明显增多，差异有显著统计学意义(均为P＜0.01，见图15-图16、表2)。

Figure 1 Expression of ICAM-1 in control group(×400).Figure 2 Expression of ICAM-1 in non-drug treatment group(×400).Figure 3 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 0-6 months(×400).Figure 4 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 0-6 months (×400).Figure 5 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 7-12 months(×400).Figure 6 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 7-12 months(×400).Figure 7 Expression of ICAM-1 in single treatment group at 13-18 months(×400).Figure 8 Expression of ICAM-1 in combined treatment group at 13-18 months(×400) 图1 空白对照组中ICAM-1的表达(×400)。图2 未用药组中ICAM-1的表达(×400)。图3 单一用药组中0～6个月时ICAM-1的表达(×400)。图4 联合用药组中0～6个月时ICAM-1的表达(×400)。图5 单一用药组中7～12个月时ICAM-1的表达(×400)。图6 联合用药组中7～12个月时ICAM-1的表达(×400)。图7 单一用药组中13～18个月时ICAM-1的表达(×400)。图8 联合用药组中13～18个月时ICAM-1的表达(×400)

Figure 9 Expression of HLA-DR in control group(×400).Figure 10 Expression of HLA-DR in non-drug treatment group(×400).Figure 11 Expression of HLA-DR in single treatment group at 0-6 months(×400).Figure 12 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 0-6 months(×400).Figure 13 Expression of HLA-DR in single treatment group at 7-12 months(×400).Figure 14 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 7-12 months(×400).Figure 15 Expression of HLA-DR in single treatment group at 13-18 months(×400).Figure 16 Expression of HLA-DR in combined treatment group at 13-18 months(×400) 图9 空白对照组中HLA-DR的表达(×400)。图10在未用药组中HLA-DR的表达(×400)。图11 单一用药组中0～6个月时HLA-DR的表达(×400)。图12 联合用药组中0～6个月时HLADR的表达(×400)。图13 单一用药组中7～12个月时HLA-DR的表达(×400)。图14 联合用药组中7～12个月时HLA-DR的表达(× 400)。图15 单一用药组中13～18个月时HLA-DR的表达(×400)。图16 联合用药组中13～18个月时HLA-DR的表达(×400)

表2 各组结膜组织中不同时相HLA-DR阳性细胞数比较Table 2 Comparison of HLA-DR positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

表2 各组结膜组织中不同时相HLA-DR阳性细胞数比较Table 2 Comparison of HLA-DR positive cells in conjunctival tissue at different time points in each group (s，eyes)

Note:Compared with former time point in the same group，*P＜0.01;Compared with control group at the same time，△P＜0.01

Group n 0-6 months 7-12 months 13-18 months Combined therapy 30 6.15±1.56 6.78±1.76 31.24±1.90＊△Single treatment 30 6.11±1.64 6.29±1.34 21.80±1.88＊△Non-drug 30 5.75±1.49 5.61±1.08 5.87±1.73 Control 30 5.34±1.47 5.81±1.39 5.66±1.52

3 讨论

长期应用抗青光眼药物能诱发眼部炎症而引起眼部不适，破坏泪膜稳定性，导致角膜表面损伤及抗青光眼手术失败。最近的研究证实抗青光眼药物中的防腐剂是引起眼部炎症的主要原因。抗青光眼药物中添加的防腐剂有多种，通常有氯化苯甲胺、硫柳汞、尼泊金、洗必泰等，而最常见的防腐剂是氯化苯甲胺［2］，它的毒副作用最大。氯化苯甲胺会导致结膜杯状细胞减少，引起基础泪液分泌减少，还能引起球结膜炎、点状角膜炎、睑缘炎、结膜纤维化和干眼症。临床及实验研究表明，长期应用含防腐剂的抗青光眼药物可诱导结膜组织过度表达炎症因子HLA-DR、ICAM-1、Fas-抗原及细胞凋亡标记物Apo2.7。

HLA-DR分子属于Ⅱ型组织相容性抗原，由位于人类第6号染色体上的HLAⅡ类基因中的DR亚区所编码，通常只表达于免疫系统细胞，如巨噬细胞(抗原递呈细胞)、B淋巴细胞、激活的T淋巴细胞等，能与外源性的抗原肽结合，在细胞表面表达，参与外源性抗原递呈途径。在免疫介导细胞活性增强和炎症情况下，如干眼症、慢性结膜炎、Sjögren综合征等，HLA-DR在结膜上皮细胞中表达增强。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族成员，是一种细胞表面跨膜糖蛋白，通过介导细胞间和细胞外基质间的黏附，参与多种炎症反应和免疫过程。ICAM-1以较低水平广泛表达于全身大多数组织中。正常情况下内皮细胞中的ICAM-1表达很低，外伤、炎症刺激等能诱导ICAM-1蛋白及mRNA的表达，增强白细胞与血管内皮间的黏附作用，从而促进炎症的发生发展。在眼部免疫活性增强及眼表相关性炎症疾病中，如眼部过敏性疾病、寄生虫感染、眼部红斑狼疮、Sjögren综合征等［3-5］，可以检测到ICAM-1的表达增强。长期使用含防腐剂的抗青光眼滴眼液［6-7］及配戴角膜接触镜［8］引起的结膜炎症反应中可以检测到HLA-DR和ICAM-1过度表达。HLA-DR和ICAM-1这两种炎性标记物和炎性反应关系密切，具有炎性标记物代表性。

本研究表明，局部应用抗青光眼药物(单一或联合用药)1 a以下者，结膜组织中HLA-DR和ICAM-1阳性表达较少，而应用抗青光眼药物1 a以上者，阳性表达增多，尤其是联合用药表达较多。炎性标记物表达增加，进一步证实结膜组织可能存在炎性反应。

Pisella等［6］及Guenoun等［7］应用新型抗青光眼前列腺素类滴眼液的临床及实验研究发现，拉坦前列素、曲伏前列素及贝美前列素不含防腐剂滴眼液长期应用与不含防腐剂噻吗洛尔滴眼液长期应用的结果与正常眼无明显差异;含防腐剂前列腺素类滴眼液和含防腐剂噻吗洛尔滴眼液均引起HLA-DR和ICAM-1表达增强，但噻吗洛尔更加明显，表明防腐剂是长期应用抗青光眼滴眼液引起炎症的关键因素，前列腺素类药物具有降低防腐剂毒性作用的功能。

前列腺素类药物滴眼液具有降压作用确切、毒副作用少、滴眼频率低等优点，逐渐在临床上成为一线降眼压药物。国内张琛等［9］研究发现玻璃酸钠滴眼液通过抗氧化损伤能降低防腐剂的毒性作用，但对于有些需长期用药的青光眼患者来说，研发不含防腐剂的抗青光眼滴眼液仍是当前的迫切需要。

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5 Pisella PJ，Brignole F，Debbasch C，Lozat PA，Cruzot-Garcher C，Bara J，et al.Flow cytometric analysis of conjunctival epithelium in ocular rosacea and keratoconjunctivitis sicca［J］.Ophthalmology，2000，107(10):1841-1849.

6 Pisella PJ，Debbasch C，Hamard P，Creuzot-Garcher C，Rat P，Brignole F，et al.Conjunctival proinflammatory and proapoptotic effects of latanoprost and preserved and unpreserved timolol: An ex vivo and in vitro study［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2004，45(5):1360-1368.

7 Guenoun JM，Baudouin C，Rat P，Pauly A，Warnet JM，Brignole-Baudouin F.In vitro study of inflammatory potential and toxicity profile of latanoprost，travoprost，and bimatoprost in conjunctiva-derived epithelial cells［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46(7):2444-2450.

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9 张 琛，王志昕，邓世靖，孙旭光.防腐剂对兔角结膜上皮细胞毒性及玻璃酸钠保护作用的实验研究［J］.眼科新进展，2008，28 (2):85-89.