苦参碱对大鼠角膜新生血管的抑制作用

于 静 张明昌

正常情况下的角膜是透明的、无血管的;在外伤、感染等病理情况下，角膜易形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)，不仅严重影响视力，而且CNV会破坏角膜正常微环境，使眼前节相关免疫赦免偏离消失，显著增加角膜移植片排斥反应的危险性［1-2］。CNV所导致的失明已成为目前眼科疾病防治领域亟待解决的重大课题之一。苦参碱是豆科植物苦参中的主要活性成分，具有抗炎、抗纤维化、抑制肿瘤生长等多种药理作用，临床应用普遍。本实验通过研究苦参碱对大鼠CNV的抑制作用，旨在为该药在眼科疾病的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及原料 苦参碱原料药粉剂购自Sigma公司;小鼠抗人VEGF单克隆抗体，SABC免疫组织化学试剂盒购自北京博奥森公司。

1.2 实验动物及分组 Wistar大鼠32只，购自同济医学院实验动物中心，雌雄不限，体质量150～200 g，健康无眼疾;随机分成对照组、实验组0.2(0.2 mg苦参碱，0.02 mL)、实验组0.4(0.4 mg苦参碱，0.04 mL)、实验组0.8(0.8 mg苦参碱，0.08 mL)，每组8只。造模后4 d开始实验组分别每天结膜下注射0.2 mg、0.4 mg、0.8 mg苦参碱溶液，对照组给予生理盐水(0.02 mL)。各组动物分别在造模后4 d、7 d、14 d、21 d断颈处死取角膜组织，2/3角膜用40 g·L－1多聚甲醛溶液于4℃条件下固定24 h，常规石蜡包埋后作苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学分析及计算机分析;另1/3角膜置于液氮罐中保存，备作RT-PCR分析。

1.3 实验方法

1.3.1 建立碱烧伤后CNV形成模型 用体积分数10%水合氯醛3 mL·kg－1腹腔注射后诱导麻醉，将直径3.0 mm滤纸浸入1 mol·L－1氢氧化钠溶液中1 min，贴敷角膜中央20 s后取下，生理盐水充分冲洗结膜囊1 min。所有实验对象均选右眼，左眼作为正常参照，造模后第2天起即用氯霉素滴眼液滴眼，预防感染。

1.3.2 CNV观察 在手术显微镜下动态观察CNV生长情况，分别于造模后4 d、7 d、14 d和21 d对CNV进行拍照，根据公式计算CNV面积:S=C/12× 3.1416×［r2－(r－l)2］，S为CNV生长面积，C为血管网的跨圆周钟点数，r为角膜半径，l为CNV长度。

1.3.3 角膜组织病理学检查 造模后不同时间点选不同剂量的苦参碱实验组随机处死2只大鼠，摘除眼球，取出角膜，40 g·L－1多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，HE染色，中性树胶封片，光镜下观察。每张切片随机选6个视野，进行CNV密度计数。

1.3.4 免疫组织化学染色 采用标记链亲和素-生物素法(SABC法)。切片用PBS清洗5 min;体积分数3%过氧化氢甲醇浸泡20 min，蒸馏水清洗3次，PBS浸洗;滴加含体积分数3%非免疫血清封闭液，室温孵育20 min，加入抗VEGF一抗(1∶100鼠抗人VEGF单克隆抗体)，－4℃过夜，PBS洗5 min×3次;加生物素化二抗(生物素化羊抗鼠IgG)，37℃湿盒孵育60 min，PBS洗5 min×3次;加SABC试剂，37℃湿盒孵育60 min，PBS洗5 min×3次;DAB显色:室温下显色，脱水、透明、封片，显微镜下观察，摄影。一抗用小鼠IgG代替作为阴性对照。以细胞呈棕黄色染色为阳性。切片在光镜下按统一放大倍数观察阳性染色的炎性细胞，VEGF阳性表达表现为棕黄色颗粒，将VEGF染色结果输入计算机，通过多媒体医用彩色图像病理分析系统(HMIAS-2000)，每张切片随机选6个视野，测量VEGF平均光密度(OD)值。

1.3.5 RT-PCR 参照Trizol试剂说明书提取总RNA，用紫外分光光度仪检测浓度和纯度，取2 μg总RNA，用RT-PCR说明书进行操作。VEGF上游引物:5’-CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG-3’，下游引物:5’-GCACTCCAGGGCTTCATCATT-3’;内参β-actin上游引物:5’-GAGCTATGAGCTGCCTGACG-3’，下游引物:5’-AGCACTTGCGGTCCACGATG-3’。反应条件为:94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，重复30个循环，72℃10 min。紫外线下通过DNA成像系统扫描，计算VEGF mRNA/β-actin mRNA的像素比值。

2 结果

2.1 CNV生长情况 对照组大鼠在造模后4 d后可见角巩缘处有新生血管芽呈毛刷状侵入透明角膜区;7 d CNV生长最为旺盛，显著变长、粗大，面积增加;14 d CNV面积达到最大，交织呈网状(图1A);到21 d CNV基本稳定，部分血管已消退。而实验组造模后4 d CNV开始侵入透明角膜区，但较对照组稀疏;7 d CNV生长细小，短而稀疏，多集中于角膜缘且生长缓慢，其生长长度及密度明显低于对照组;到14 d CNV面积增大，但并未交织呈网状(图1B);21 d CNV未明显向角膜中央进展，部分新生血管已退化。造模后实验组大鼠在各时间点的CNV面积均小于对照组，差异均有显著统计学意义(均为P＜0.01);实验组0.2的CNV面积明显大于实验组0.4和实验组0.8(均为P＜0.01)，而实验组0.4和实验组0.8之间差异无统计学意义(q=1.586 0、0.972 2、3.070 0、2.558 1;见表1)。所有实验组未观察到与注射苦参碱相关的副作用。

2.2 角膜组织病理学检查结果 对照组大鼠4 d时角膜可见大量炎性细胞及少量新生血管，7 d时可见新生血管增多，14 d见大量新生血管，管腔粗大、内有红细胞(图2A)，21 d时新生血管基本稳定;各实验组在4 d时可见有炎性细胞侵润及少量新生血管，7 d时可见新生血管，14 d时见较少新生血管管腔，管腔小，排列稀疏(图2B-2D)，21 d时部分新生血管已退化。造模后14 d，对照组与实验组0.2、实验组0.4、实验组 0.8 CNV密度计数平均值分别是21.11±2.14、17.83±2.32、11.00±2.37、10.87± 2.41，差异有统计学意义(P＜0.01);实验组0.4和实验组0.8比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

Figure 1 CNV at 14 days after alkali burn in control group and experimental group with 0.4 mg Matrine 碱烧伤后第14天，对照组(A)和苦参碱实验组0.4(B)角膜CNV

2.3 免疫组织化学染色结果 在正常角膜组织中，VEGF在上皮及基质中有微弱表达，对照组造模后4 d角膜上皮层及浅基质层可见VEGF表达，7 d角膜基质层内VEGF表达显著增加，14 d角膜基质层内可见大量VEGF表达(图3A)，21 d角膜基质层内VEGF表达趋于下降。各实验组角膜VEGF表达均较对照组明显减少(图3B-3D)。且造模后各时间点各实验组角膜VEGF的平均光密度值均小于对照组，差异均有统计学意义(均为P＜0.05);实验组0.2的VEGF平均光密度值明显大于实验组0.4 (P＜0.05)，而实验组0.4和实验组0.8比较，差异无统计学意义(q=1.1127、2.8285、0.7273、0.6447;见表2)。

2.4 RT-PCR结果 对照组大鼠角膜中VEGF mRNA的表达随时间延长逐渐增加，到造模后14 d达到高峰，随后出现下降。当采用苦参碱干预后，角膜中VEGF mRNA的表达量明显减少，并随着苦参碱的药物浓度增加，VEGF mRNA的表达逐渐减少(图4、表3)。

表1 不同时间点的CNV面积Table 1 CNV area at different time points (s，S/mm2)

表1 不同时间点的CNV面积Table 1 CNV area at different time points (s，S/mm2)

Group n The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 10.25±0.15 19.60±1.31 26.18±1.28 25.89±1.38 Experimental 0.2 6 7.81±0.14 14.75±1.95 22.44±1.36 21.78±1.29 Experimental 0.4 6 6.54±0.14 10.33±1.40 16.19±1.37 15.53±1.34 Experimental 0.8 6 6.48±0.14 9.98±1.05 15.58±1.37 14.66±1.41 F 8.051 7 7.854 1 27.585 3 7.610 0 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 不同时间段角膜VEGF的表达Table 2 Corneal VEGF expression at different time points (s)

表2 不同时间段角膜VEGF的表达Table 2 Corneal VEGF expression at different time points (s)

Group n The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 0.341 4±0.001 3 0.531 9±0.001 4 0.6523±0.001 4 0.584 2±0.001 4 Experimental 0.2 6 0.284 1±0.001 3 0.421 1±0.001 3 0.532 9±0.001 5 0.498 1±0.015 3 Experimental 0.4 6 0.212 8±0.001 4 0.301 4±0.001 3 0.403 2±0.001 3 0.354 2±0.003 0 Experimental 0.8 6 0.202 4±0.001 3 0.301 0±0.001 4 0.402 8±0.001 4 0.353 4±0.011 8 F 46.575 2 69.897 3 4.478 2 9.160 6 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01

Figure 2 Corneal HE staining at 14 days after alkali burn in control group and experimental group(×200).A:In control group，thick and intensive new vessels were seen in corneal stroma，and inflammatory cells filtration was also found;B:In experimental group with 0.2 mg Matrine，few new vessels and inflammatory cells were seen;C，D:In experimental groups with 0.4 mg and 0.8 mg Matrine，few new vessels in corneal stroma were seen 碱烧伤后14 d，对照组和苦参碱实验组角膜HE染色(×200)。A:对照组角膜基质内新生血管数量多，管腔较粗大，并有大量炎性细胞浸润;B:实验组0.2角膜基质内新生血管数量少，管腔小且基质层内炎性细胞少;C、D:实验组0.4和实验组0.8角膜基质层新生血管明显减少

Figure 3 Corneal VEGF immunohistochemistry at 14 days after alkali burn in control group and experimental group(×200).A:In control group，the strong positive expression of VEGF was seen in corneal stroma;B:In experimental group with 0.2 mg Matrine，the positive expression of VEGF in corneal stroma reduced;C，D:In experimental groups with 0.4 mg and 0.8 mg Matrine，the positive expression of VEGF in corneal stroma reduced obviously 碱烧伤后14 d，对照组和苦参碱实验组角膜VEGF免疫组织学化染色结果(×200)。A:对照组角膜基质层区域VEGF呈强阳性表达;B:实验组0.2角膜基质层区域VEGF表达减少;C、D:实验组0.4和实验组0.8角膜基质层区域VEGF表达明显减少

Figure 4 VEGF mRNA level at different time points.A:Control group;B:Experimental group with 0.2 mg Matrine;C:Experimental group with 0.4 mg Matrine;D:Experimental group with 0.8 mg Matrine 不同时间点VEGF mRNA水平。A:对照组;B:实验组0.2;C:实验组0.4;D:实验组0.8)

表3 不同时间点角膜VEGF mRNA的表达Table 3 Corneal VEGF mRNA expression at different time points (s)

表3 不同时间点角膜VEGF mRNA的表达Table 3 Corneal VEGF mRNA expression at different time points (s)

Group n Ratio of VEGF mRNA/β-actin mRNA The 4th day The 7th day The 14th day The 21st day Control 6 0.270±0.013 0.390±0.024 0.430±0.025 0.400±0.037 Experimental 0.2 6 0.190±0.011 0.300±0.018 0.340±0.014 0.310±0.025 Experimental 0.4 6 0.160±0.014 0.250±0.013 0.290±0.013 0.280±0.015 Experimental 0.8 6 0.130±0.010 0.170±0.015 0.200±0.021 0.180±0.011 F 26.556 29.873 3.645 6.374 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01

3 讨论

苦参碱是近年来从中药豆科植物苦参、苦豆子和广豆根中分离提取的有效单体成分，具有多种药理活性［3］。它有类似于糖皮质激素的直接抗炎作用［4］，对多部位成纤维细胞的增生具有抑制作用，对多种恶性肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用，同时，苦参碱还对多种细菌和病毒有明显的抑制作用。蒋瑶祁等［5］发现苦参碱通过下调VEGF的表达抑制视网膜微血管内皮细胞的增生，且对高糖引起的VEGF表达上调同样存有抑制作用，增加了其眼表使用的可行性。

Edelman等［6］研究发现，化学烧伤后24 h以内为非增生期，出现角膜水肿和混浊但无CNV，第2－4天为CNV增生期，第7天达到高峰，之后为血管退行期，CNV逐渐退行吸收。本实验的大鼠碱烧伤模型具有类似的角膜急性炎症反应，但碱烧伤CNV的高峰期持续时间更长，造模后7～14 d达到高峰期，之后才见CNV消退。本实验在蛋白水平和基因水平均证实苦参碱对CNV中VEGF的表达有明显抑制作用。实验组免疫组织化学染色的平均光密度值图像分析显示，在碱烧伤模型中，VEGF表达有其变化过程，并和宏观观察CNV面积变化基本同步。VEGF在造模后14 d表达量最高，21 d开始下降，与对照组比较，各实验组在造模后4 d、7 d、14 d和21 d差异均有统计学意义;但并未见实验组0.4和实验组0.8之间差异有统计学意义，其原因可能是因为两组在这阶段VEGF的表达均已明显下降并趋于稳定。

正常角膜中，VEGF在上皮、基质和角膜缘血管内皮细胞有表达，其受体是两种酪氨酸激酶受体: fms样酪氨酸激酶1(fms-like tyrosine kinase，flt-1)和胎肝激酶1(fetal liver kinase 1，flk-1)，这两种受体在角膜缘血管内皮细胞上有表达［7］。VEGF的作用在于它可以刺激内皮细胞分泌蛋白酶和蛋白酶原活化因子，从而导致血管基底膜的降解，细胞得以侵入周围基质，迁移、增生，最终分化成一个新的、含有一个空腔的血管［8］。在多种原因引起的CNV中，VEGF mRNA及其蛋白在浸润的白细胞、新生血管内皮细胞上表达明显升高［9］，因此本实验从基因水平下半定量检测VEGF mRNA表达情况，每个实验组角膜中VEGF mRNA的表达随时间延长逐渐增加，到造模后14 d达到高峰，随后出现下降。当采用苦参碱干预后，角膜中VEGF mRNA的表达量明显减少，并随着苦参碱的药物浓度增加，VEGF mRNA的表达逐渐减少，表明苦参碱能够有效抑制VEGF mRNA的转录，降低VEGF的表达，阻碍内皮细胞的增生，从而抑制CNV的生长。这也可能是苦参碱抑制CNV生成的机制之一。

本研究结果表明，苦参碱可能通过降低VEGF的表达而达到抑制CNV生长的目的，为临床上CNV的治疗提供了一条新的参考途径。

1 Panda A，Vanathi M，Kumar A，Dash Y，Priya S.Corneal graft rejection［J］.Surv Ophthalmol，2007，52(4):375-396.

2 Coster DJ，Williams KA.The impact of corneal allograft rejection on the long-term outcome of corneal transplantation［J］.Am J Ophthalmol，2005，140(6):1112-1122.

3 刘 梅，刘雪英，程建峰.苦参碱的药理研究进展［J］.中国中药杂志.2003，28(9):801-804.

4 郑马庆，潘伟娜，朱延勤.苦参碱滴眼液对家兔实验性眼炎的药效学研究［J］.中药新药与临床药理，2003，14(2):109-111.

5 蒋瑶祁，彭辉灿，肖启国，李 萍，杨 杰.苦参碱对大鼠视网膜微血管内皮细胞的增生VEGF表达的影响［J］.眼科研究，2008，26 (1):84-88.

6 Edelman JL，Castro MR，Wen Y.Correlation of VEGF expression by leukocytes with the growth and regression of blood vessels in the rat cornea［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1999，40(6): 1112-1123.

7 Van Setten GB.Vascular endothelial growth factor in normal human corneal epithelium:Detection and physiological importance［J］.Acta Ophthalmol Scand，1997，75(6):649-652.

8 何有娣.FGF和VEGF在血管生成中的作用［J］.国外医学药学分册，2001，28(6):326-329.

9 Kvanta A，Sarman S，Fagerholm P，Seregard S，Steen B.Expression of matrix metalloproteinase-2 and vascular endothelial growth factor in inflammation-associated corneal neovascularization［J］.Exp Eye Res，2000，70(4):419-428.