家蚕促咽侧体素受体基因克隆及发育表达

邱娜莎， 刘 畅， 严雅静， 魏兆军

（合肥工业大学 生 物与食品工程学院，安徽 合 肥 230009）

0 引 言

促咽侧体素（Allatotropin，简称AT）是一种多功能的神经肽，其功能包括促进保幼激素（JH）和促肌蛋白的生物合成、加速心脏搏动，抑制活性离子运输等［1］。家蚕促咽侧体素是一组结构相关的神经肽家族的成员之一，这组神经肽在昆虫和其他无脊椎动物中广泛分布。神经肽受体的鉴定可以通过它们的生化分离、基因克隆及生物活性检测等方法实现，它们通常是根据第1次被发现的活性来命名的，AT受体首先是在烟草天蛾中得以鉴定的［2］。

G蛋白偶联受体（GPCRs）家族的绝大多数成员在结构上都有一个7次疏水跨膜区域，神经肽作为配体通过结合其高亲和性受体对细胞靶点起作用［3］。神经肽结合产生的信号可以介导一个GTP结合蛋白（G蛋白）的激活，导致第2信使的水平的改变，反之，使靶细胞和生物物体的功能产生变化［4］。本文克隆了家蚕促咽侧体素受体基因（Bommo－ATR），对其蛋白三维结构和跨膜结构进行预测，构建系统遗传树，并进行了mRNA的发育变化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

家蚕品种P50由中国农业科学院蚕业研究所提供，饲养条件（23±1）℃、每日光照14h，黑暗10h、70%～80%的相对湿度。从幼虫5龄第1天起一直到成虫第1天（其中包括幼虫5龄阶段7d、吐丝期3d、蛹期8d、成虫期1d，共19d）解剖家蚕的脑－咽下神经节复合体（Br－SG），每天解剖90头，30个组织为一个样品，每天取3个样品。整个操作在冰上进行，解剖后将装有脑－咽下神经节复合体的EP管迅速放入－80℃冰箱中保存备用。

1.2 RT－PCR

利用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa，大连）提取家蚕Br－SG的RNA，利用cDNA第1链合成试剂盒（TaKaRa，大连）合成cDNA，然后BRO16F和BRO16R扩增家蚕ATR的ORF，见表1所列。PCR产物经电泳后，在紫外条件下，用手术刀切出目的片段，再用胶回收试剂盒（TaKaRa，大 连）连 接 到 PMD－18T 载 体 中（TaKaRa，大连），筛选阳性克隆后进行序列测定（上海生工公司，上海）。

表1 扩增家蚕ATR所用的引物序列

1.3 蛋白结构模拟

通 过 SWISS－MODEL 的 First Approach mode（简捷模式）行蛋白质三维结构的模拟。SWISS－MODEL服务器是以用户输入信息的最小化为目的设计的，直接提供家蚕ATR蛋白的氨基酸序列，选择简捷模式，在CPHmodels 2.0 server服务器上做结构预测，得到蛋白质三维结构后，运用RASWIN软件来看蛋白质分子的三维模型［5］。

1.4 荧光定量PCR

对于解剖所得的19d的样品提取总RNA，使用DNase I处理除去基因组DNA后，取1μg总RNA反转录为cDNA（总体积25μL），取约10ng cDNA进行荧光定量PCR反应。利用纯化后的PCR产物定量后来制作标准曲线 （含108～103个基因拷贝数）。实时荧光定量PCR反应采用荧光染料SYBR Green I（TaKaRa，大连）在Bio－rad iCycler iQ （美国伯乐公司）用0.2mL薄壁PCR管（AXYGEN，美国）进行。荧光定量PCR反应体系为20μL（2个引物各1μL，模板cDNA 1μL，SYBR Green I Real－time PCR Master Mix 10μL，双蒸水2μL）。用iQ 5Multicocolor Real－Time PCR Detection System （Bio－Rad）程序执行，PCR反应程序为95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s；循环35次；熔解曲线从55～95℃，每5℃读取一个荧光值。

本文采用以上步骤中稀释成不同的浓度梯度的PCR回收产物作为已知起始拷贝数的标准品，利用Real－Time PCR测定不同稀释梯度的CT值，进而制作成标准曲线。以拷贝数的lg值为横坐标，以CT值为纵坐标做标准曲线，公式为：

其中，a值根据不同基因和不同PCR片段而不同。得出标准曲线后可以根据机器测定的未知样品的CT值代入公式，得到样品的起始拷贝数。

2 结果与分析

2.1 家蚕ATR的扩增和序列分析

以家蚕脑和咽下神经节的cDNA作为模板，利用BRO16F和BRO16R扩增获得的PCR产物电泳后条带清晰，大小约1.3kb，与预期的结果一致，如图1所示。

图1 扩增家蚕ATR的ORF的PCR结果

克隆到T载体后，序列测定获得1 254bp的序列，分析表明包含家蚕ATR的ORF的全长序列，编码416个氨基酸，如图2所示。本文从测定的Bommo－ATR与基因组预测的比较来看，存在5个碱基差别，但氨基酸仅有1个发生变化（即23位的H替换为Y）。

Bommo－ATR推导氨基酸序列的二级结构预测［6］表明，家蚕的ATR为7次穿膜蛋白，N－端位于胞外，C－端位于胞内。家蚕ATR蛋白跨膜结构域预测，如图3所示。从图3可以看出，7个穿膜结构域（transmembrane region，简称TM）分别为（按照416个氨基酸的的相对位置，方向为N－端 → C－端）：75～97、110～132、147～169、190～209、237～259、299～321和331～353。Bommo－ATR的结构符合GPCR家族成员的典型特征［7］。

图2 家蚕ATR ORF核苷酸和氨基酸序列

图3 家蚕ATR蛋白跨膜结构域预测

进一步利用SWISS－MODEL的First Approach mode预测家蚕ATR的3D结构，如图4所示，结果表明，家蚕ATR蛋白的3D结构包含18个螺旋，其中主要的α－螺旋有7个，与7次跨膜结构一致。

利用NJ方法，依据不同物种ATR的氨基酸序列构建的系统树，如图5所示，其中人的Orexin受体被选为外群。结果表明，家蚕的ATR与烟草天蛾的ATR关系最接近，其次与家蚕的另一个 促 咽 侧 体 素 受 体 BNGR－A5［8］（GenBank NM－001134268）关系较接近，家蚕的ATR与埃及伊蚊［9］、小金蜂［10］、赤拟谷 盗［11］的 ATR 距 离较远，这与传统的系统关系一致［12］。

图4 预测的家蚕ATR蛋白3D结果

图5 基于不同昆虫ATR氨基酸序列的系统树

2.2 家蚕ATR发育变化

从家蚕5龄第1天到发蛾第2天，每天解剖脑和咽下神经节复合体，用于分析家蚕ATR的mRNA发育变化［13－14］。本试验通过设定不同浓度梯度的ATR基因PCR产物作为荧光定量PCR的标准品，制备定量的标准曲线。本试验利用荧光定量PCR的方法最低可以检测到103拷贝数的模板，家蚕ATR基因的标准曲线的线性拟合方程为：

其中，Y为CT；X为模板拷贝数的lg值。标准曲线在103～108之间显示了很强的线性相关性，定量标准曲线的相关性系数为0.997 5，表明所制作的标准曲线非常理想，适合用来检测ATR基因的拷贝数。ATR基因扩增标准曲线如图6a所示。ATR基因荧光定量PCR反应的熔解曲线如图6b所示。

由图6b可看出，随着温度的升高，荧光信号随之下降。这是因为温度的升高会导致越来越多的DNA双链被打开，与之结合的SYBR GreenⅡ染料也被释放出来。荧光强度发生变化的拐点（熔点，Tm）处可以清楚地看到一个单一的峰，PTTH基因大约是在85℃，这个峰所对应的是扩增产物的熔解温度。同时除了单一的峰之外，没有杂峰，表明实验中没有污染、引物二聚体和假阳性现象。

图6 家蚕ATR基因扩增标准曲线和熔解曲线

家蚕ATR基因发育变化如图7所示。

图7 家蚕Br－SG中ATR基因mRNA发育变化

从图7可以看出，5龄幼虫、预蛹期、蛹期和成虫4个阶段中，5龄幼虫表达量最高，其次为蛹后期，蛹前期和成虫阶段表达量最低。5龄幼虫第2天表达量最高，5龄1～5d持续维持较高的表达水平，化蛹后持续下降，蛹后期表达量重新升高，化蛾时急剧降低。幼虫期ATR表达量水平较高，可能是该阶段家蚕ATR与AT结合，促进分泌保幼激素（JH），从而维持幼虫的正常发育［1］。

化蛹后表达量下降，此时变态发育占主导角色，幼虫体态的维持被打破，与ATR表达量较低是相适应的。蛹后期表达量重新升高，可能与AT在这个时期促进成虫肌蛋白的合成有关。化蛾后表达量下降，与这个时期家蚕各神经肽表达量均较低的情况相吻合［15］。

3 结 论

本研究利用RT－PCR方法克隆了家蚕促咽侧体素受体（Bommo－ATR）全长基因序列，并运用实时荧光定量PCR技术对家蚕5龄期至化蛾共19d的ATR表达量进行分析，主要结果有：

（1）家蚕ATR基因全长ORF序列为1 254bp，编码416个氨基酸。预测的氨基酸序列的二级结构为7次跨膜蛋白，符合GPCR家族成员的典型特征。

（2）家蚕脑－咽下神经节复合体（Br－SG）中ATR五龄1～5d持续维持较高的表达水平，化蛹后持续下降，蛹后期表达量重新升高，化蛾时急剧降低。

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