呋塞米注射液细菌内毒素检查法的建立

(河南省食品药品检验所，河南 郑州 450003)

呋塞米注射液为利尿药，在2005年版《中国药典(二部)》收载的质量标准中无热原检查项。为了加强质量控制，笔者对呋塞米注射液中细菌内毒素检查法的可行性进行了研究。

1 仪器与试药

DC－3A型干式恒温器(南京三爱斯技术开发有限公司)。呋塞米注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司，规格为2 mL∶20 mg，批号为200907131;天津金耀氨基酸有限公司，规格为2 mL∶20 mg，批号为0907162;陕西京西药业有限公司，规格为2 mL∶20 mg，批号为0904201;郑州羚锐制药股份有限公司，规格为2 mL∶20 mg，批号为0906281);鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，规格为0.5 mL，批号分别为 0902132，0710262，灵敏度分别为 0.125，0.5 EU/mL;福州新北生化工业有限公司，规格为0.5 mL，批号为08020912，灵敏度为0.5 EU/mL;湛江博康海洋生物有限公司，规格为 0.5 mL，批号为 0901122，灵敏度为 0.125 EU/mL);细菌内毒素工作标准品(以下简称WSE，中国药品生物制品检定所，效价为120 EU/支，批号为150601－200862);细菌内毒素检查用水(以下简称BET用水，中国药品生物制品检定所，规格为10 mL，批号为W2008－4)。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂标示灵敏度(λ)的复核

依法[1]对试验用鲎试剂进行灵敏度复核。结果4批鲎试剂灵敏度测试值(λc)均在0.5～ 2.0 λ之间，表明鲎试剂灵敏度符合规定，可用于试验。

2.2 样品内毒素限值(L)的确定

按照2005年版《中国药典(二部)》相关方法[1]，根据公式L=K/M，[K为每人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂 K=5 EU/(kg×h);M为每人每公斤体重每小时的最大供试品剂量]，参照该药品说明书及《临床用药须知》[1－2]，滴注速度每分钟不超过 4 mg，得 M=4.0 mg(kg×h)，则 L=1.2 EU/mg。

2.3 样品预干扰试验

由于所用鲎试剂的灵敏度(λ)为0.5 EU/mL，则样品的最大有效稀释倍数(MVD)=CL/λ=24(倍)，采用不超过最大有效稀释倍数即 3，6，12，24 倍的溶液(质量浓度分别为 3.3，1.7，0.8，0.4 g/L)作为供试品阴性对照(NPC)管，根据使用鲎试剂的灵敏度，在其中分别添加2 λ的细菌内毒素，制成供试品阳性对照(PPC)管，用 λ=0.5 EU/mL的鲎试剂，分别与4个系列溶液反应，各重复2管，同时作阴性对照(NC)和阳性对照(PC)各2管，做2个批号样品预干扰试验[1，3]，结果见表1。可见，呋塞米注射液稀释至0.8 g/L时，不再对试验产生干扰。

表1 干扰预试验结果

2.4 供试品正式干扰试验

使用鲎试剂，将呋塞米注射液稀释12倍(0.8 g/L)，进行正式干扰试验[1，3]。结果见表 2。可见，4 批样品的 12 倍稀释液(0.8 g/L)对两个厂家的鲎试剂干扰试验，结果内毒素标准品水溶液反应终点浓度的几何平均值(Es)为 0.5 ～2.0 λ(包括 0.5 λ 和 2.0 λ)，内毒素供试品溶液反应终点浓度的几何平均值(Et)为0.5～2.0 Es(包括 0.5 Es和 2.0 Es)，说明该样品稀释 12 倍后确已排除干扰作用。

2.5 样品细菌内毒素检查

取4个批号样品，用BET用水分别溶解稀释制成0.8 g/L溶液，用鲎试剂 λ为0.125 EU/mL，按检查法进行操作和结果判断，以 L为1.2 EU/mg作为评定标准，结果见表3。可见，4个批号的呋塞米注射液采用两个厂家生产的鲎试剂作细菌内毒素检查[1，4]，结果均小于限值(1.2 EU/mg)。

表2 干扰试验结果

3 讨论

呋塞米注射液工艺处方中使用的辅料有氢氧化钠、氯化钠、亚硫酸钠、甲醛合次硫酸氢钠、依地酸二钠等，不同生产企业的辅料使用情况存在差异。本试验充分考虑到了这种差异，选取了有代表性的4个厂家的呋塞米注射液，基本排除了不同处方工艺的影响。

由预干扰试验和正式干扰试验结果可知，呋塞米注射液在稀释至0.8 g/L及以下浓度与灵敏度为0.5 EU/mL的鲎试剂反应无干扰影响，本品可以采用细菌内毒素检查法进行质量控制，其细菌内毒素检查项可拟订为“每1 mg呋塞米中含内毒素的量应小于 1.2 EU”。

表3 样品的细菌内毒素检查结果

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[M].北京:化学工业出版社，2005:附录ⅪE.

[2]国家药典委员会.临床用药须知(化学药和生物制品卷)[M].北京:化学工业出版社，2005:329.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社，2005:287.

[4]张广伟，周继春.尼可刹米注射液细菌内毒素检查法的建立[J].中国药业，2010，19(6):32－33.