康复训练对双侧海马梗死大鼠学习记忆能力与长时程增强的影响

赵英子，张小明，房威，何丽娟，张震

学习记忆是大脑最基本也是最重要的高级神经功能之一，是中枢神经系统功能的整合，海马与学习记忆的关系密切。众多研究表明[1-2]，损毁双侧海马动物的学习记忆能力明显下降，对大鼠的分辨学习、防御、条件反应的保持及空间习得能力都有破坏。在学习记忆的神经机制中，关于突触的可塑性问题近来倍受关注。有较多文献报道了与学习行为有关的长时程增强(long-term potentiation,LTP)样突触效应变化[3-4]。有报道齿状回突触效应与行为训练的关系，发现动物出现与行为反应相对应的突触效应增强。脑梗死常引起学习记忆障碍，行为训练可明显改善神经功能。目前有关行为训练促进脑梗死大鼠神经功能的恢复主要集中在运动功能评定及学习记忆改善的行为研究，而由行为训练引起脑梗死大鼠学习记忆改善的基础——海马CA3区习得性LTP的变化报道较少。本研究通过康复训练对脑梗死大鼠学习记忆能力和海马CA3区习得性LTP的影响，初步探讨脑梗死后运动康复对中枢神经系统尤其是对海马神经元的功能及突触可塑性的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁级SD大鼠30只，体重(210±10)g，8～9周龄，由本院实验动物中心提供。随机分为脑梗死自由活动组(模型组)、脑梗死康复训练组(康复组)和正常组，每组各10只。

1.2 方法

1.2.1 双侧海马梗死模型制作及电极埋植 大鼠用20 g/L戊巴比妥钠按50 mg/kg常规麻醉后，将其俯卧于脑立体定位仪上，沿头颅正中切开头皮暴露颅骨。无菌条件下进行慢性电极埋植，切开头皮，暴露左脑颅顶，用颅骨钻于海马、内嗅区穿通纤维PP位置各钻一小孔，记录电极为绝缘金属电极。直径0.2 mm，用微电极推进器置于海马CA3区锥体细胞层，按布瑞希图谱并订正，定位内嗅区(Ap)3.0～3.4 mm，门齿钩(L)3.3～3.5 mm，耳间线(H)3.8～4.2 mm。参考电极用小螺钉固定在颅骨上。做电极埋植术时，按定位参数上下移动记录电极和刺激电极，选能记录到最大群体峰电位(population spike,PS)的部位，然后用牙托粉固定[5]。

双侧海马梗死模型制作方法：在前囟后4.8 mm、中线向左右旁开3.6 mm处，分别用牙科钻轻轻钻一个直径约1 mm的骨窗，光纤管尾端至皮层下3.2 mm(海马CA3)。注射虎红70 mg/kg后，立即通过光纤管照射一侧海马组织。照射完毕时再补充原虎红剂量的一半，然后立即进行另一侧的冷光源照射，光照强度0.37 W/cm2，照射时间各30 min。术后缝合头皮正常喂养。模型组关在笼中不给予任何训练；康复组造模后休息4 d，于第5天开始康复训练。

1.2.2 康复训练

1.2.2.1 运动功能训练 将大鼠放于长100 cm，直径60 cm的圆形网状仪中，手摇转动，25 r/min，让其被动跑笼；10 min后将大鼠放于长150 cm，宽2 cm的方木棒上以食物诱导其行走，训练10 min，共训练30 d。

1.2.2.2 学习记忆能力训练 2周后采用划分4个象限(按顺时针方向定义为A、B、C、D)的自制直径1.2 m，高0.5 m圆桶，盛水后按0.5%～1.5%的比例加入奶粉，使水成为不透明乳白色，水温控制于22°～23°，将一直径11 cm平台固定于A象限，平台在水面下1 cm。大鼠从另外3个象限随机放入桶中，如3 min内找不到平台，则将其在平台上放置15 s。每次训练间隔5 min，每天3次，共训练30 d。

1.3 行为学测试

1.3.1 Y-型迷宫 Y-型迷宫为一个三等臂式迷宫，每臂顶端设一信号灯，信号灯亮后6 s，此臂即为危险区，通以36 V交流电，刺激大鼠从所在的亮臂跑到暗臂。训练中始终有一臂为安全区，安全区按无规则的次序变换。如果大鼠在通电后从所在亮臂跑到另一亮臂记为错误，跑到暗臂则为正确。一天内连续分段训练大鼠，每10次为一段，两段间大鼠休息2 min。放入明室至进入暗室的时间称作潜伏期(PS潜伏期)。记录大鼠掌握迷宫结构(连续10次测试中有9次正确即为掌握迷宫结构)所需的训练次数。

1.3.2 被动回避反应 将多功能条件反应箱平放在60 cm高的桌边，跳板完全悬空，将大鼠尾对门洞平放在跳板上，大鼠能很快找到门洞并进入反应箱。关闭门洞，并用适宜电压电击前爪5～10 s。如此反复3次，24 h后重复测定大鼠在跳板上停留的潜伏期，记为电击后步入潜伏期，最长观察时间为300 s，统计值采用中位数。凡达到300 s仍不进入反应箱者，计为300 s。

1.4 在体LTP记录 行为学测试前及运动康复训练、行为学测试完毕4 h后，让动物在一自制小笼中处于安静状态，以刺激器和隔离器输出频率0.7 Hz、波宽0.1 ms的方波进行单刺激，强度相当于引起突触反应和峰电位最大振幅50%，于CA3区锥体细胞层记录LTP。诱发电位经微电极放大器、SJ-F处理放大器振幅及A/D卡放大器三级放大后，用计算机采集处理和分析。计算PS增幅：

不同时间LTP的比较采用学习前后振幅增大的百分率。记录60次学习后和学会后PS增幅，不到60次即学会的大鼠记录60次学习后PS增幅。实验结束后，对动物记录电极、刺激电极做定位检查，定位不准确者给予剔除。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，采用t检验。

2 结果

2.1 行为学测试 模型组掌握迷宫结构所需训练次数多于正常组和康复组(P<0.05)，正常组和康复组无显著性差异(P>0.05)。被动回避反应中，模型组电击后步入潜伏期短于正常组和康复组(P<0.05)，正常组和康复组无显著性差异(P>0.05)。见表1。

表1 三组学习记忆能力比较

2.2 PS增幅及PS潜伏期 60次Y-型迷宫训练后，康复组PS增幅大于模型组(P<0.05)；而当康复组和模型组Y-型迷宫分辨学习达标后，PS增幅比较无显著性差异(P>0.05)。见表2。

Y-型迷宫分辨学习后，康复组大鼠PS潜伏期较模型组缩短(P<0.05)。见表3。

表2 大鼠Y-型迷宫分辨学习后海马CA3区PS增幅比较(%)

表3 大鼠Y-型迷宫分辨学习后海马CA3区PS潜伏期比较(s)

3 讨论

研究表明，海马与近期记忆有关，损伤海马可引起近期记忆的高度丧失，致使动物或患者丧失学习新事物和新技巧的能力；在大鼠实验中还观察到海马参与近期记忆中的情节记忆过程，与空间位置的学习有关，海马损伤或切除海马，将造成顺行性遗忘症[3,6]。

在脑梗死等脑缺血性疾病时，由于谷氨酸兴奋毒性作用，产生大量的自由基和兴奋性氨基酸，导致细胞内钙离子超载，造成神经细胞变性坏死，影响神经元之间的信息传递，并最终导致脑功能障碍。海马CA3区对缺氧缺血特别敏感。刘汇波等发现，大鼠双侧颈总动脉结扎后存活30 d时，动物的海马CA3区神经元数目显著减少，大量神经细胞的轴突缺失，海马锥体细胞密度减低；模型大鼠还存在着与神经元损伤呈正相关的学习记忆障碍[7-9]。

本实验结果表明，双侧海马梗死后，大鼠出现明显的学习记忆能力下降，证实海马对学习记忆功能的重要作用。康复治疗后Y-型迷宫分辨学习的能力明显优于模型组，说明康复训练能促进海马梗死大鼠的学习记忆功能的恢复。康复训练可能通过改变梗死大鼠海马的突触结构，活化突触间传递通路，促进习得性LTP的产生[10-12]，进而增强海马突触效应的可塑性，改善大鼠认知功能，最终促进海马梗死大鼠学习记忆功能的恢复。

人们发现在行为学习时，突触传递有可塑性变化。行为训练后，检测到齿状回出现突触效应的增强，与行为条件反射的获得是相互平行的。易立等观察到大鼠条件饮水反应建立时，海马CA3区突触效应传递功能增强，并称之为习得性LTP。这些结果表明，行为学习中突触效应有LTP样变化出现，提示它可能编码学习和记忆。

实验心理学研究表明[13]，学习的效率会受到学习任务安排形式的影响。紧跟在原学习之后的后来经验对先前学习的材料有干扰作用；同样先前学习材料对同忆某些随后学习的材料亦有干扰，这种现象称为“倒摄干扰与前摄干扰”。有人对大鼠进行两种学习任务训练，发现在完成A训练后紧接着进行B训练，对海马CA3区习得性LTP呈阻抑作用，而在完成A训练后间隔4 h方进行B训练，却能加快习得性LTP的发展，PS峰值很快增至最高水平。

根据习得性LTP在4 h达到峰值的特点，本实验中所有LTP测定值均为运动训练或Y-型迷宫学习后4 h测定所得。结果发现康复组与模型组Y-型迷宫学习60次后PS峰值均增加，表明两组大鼠均产生习得性LTP；康复组大鼠PS增幅较大，且PS潜伏期明显缩短，与模型组相比差异有显著性。但是当两组Y-型迷宫正确分辨率达90%以上时，两者PS增幅却一样多。分析其原因可能是平衡、抓握、旋转等康复训练实质是偏瘫鼠的运动再学习，这种训练已使康复组大鼠产生一种习得性LTP，在此基础上再经Y-型迷宫学习则产生更大的LTP，即出现LTP的叠加效应；又由于PS增大有“饱和”现象[3,6]，即一旦达到最高水平就不再继续增大，因此通过相互叠加，PS峰值很快发展到饱和水平。

行为训练诱导的突触效应增强可能存在一定的启动机制，两种行为间隔进行，都可正常地引起PS增大，而后一训练引起的增大，却是在前一训练已使PS峰值增大的基础上进行的，即两种训练作业所引起的PS峰值增大，不仅不互相干扰，而且还可以互为基础，相互叠加，使PS峰值很快发展到饱和；同时行为学习改变树突和突触形态结构，增加运动皮层和海马突触数和密度，活化海马和运动皮层的传入通路；以及NMDA受体密度的增多，加强NMDA受体依赖LTP的产生，因而运动训练改变突触的传递效率。这也是运动训练促使脑梗死大鼠学习记忆恢复的原因之一。

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