熊胆精制液储存中的质量稳定性研究

韩秋伟，张晓旭

（1.黑龙江林业职业技术学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.中山大学药学院）

熊，食肉目，是属于熊科的杂食性大型哺乳类，以肉食为主，别名黑瞎子。种类较少，全世界仅有7种，我国有3种：马来熊、棕熊、黑熊。熊，全身都是宝，其中以熊胆最有价值。黑熊为国家二级保护动物，为保护野生熊资源，近几年养熊采胆技术得到了很快的发展。

熊胆粉是熊科动物黑熊经胆囊手术引流胆汁的干燥品。

熊胆作为中国四大动物药材之首，入药已有几千年历史，素有“药中黄金”之美誉。《本草纲目》载：熊胆味苦、性寒，归肝胆心经，无毒，能清热、平肝、利胆、明目、杀虫。现代药理学研究证实：熊胆具有清热解毒、抑菌抗炎、保肝护肝、利胆溶石、降脂降压、镇咳平喘、去翳明目、抗疲劳等多方面的药理功能，尤其是治疗胆囊炎、胆结石更是功效独特。

熊胆主含牛黄熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、胆酸，多与牛黄酸或甘氨酸等形式结合胆汁酸而存在，另含胆固醇、胆红素及无机盐等。根据熊胆具有的药理作用，目前熊胆制剂发展的迅速。从简单的直接应用熊胆粉入药，发展到利用精制熊胆粉入药的阶段。精制熊胆粉是除去熊胆粉中蛋白质和粘液质、胆汁酸等杂质，对制备液体制剂，保证颜色、气味、澄明度、避免不良反应发生等质量问题得到了保证。为了适应大生产，需要批量生产精制液。本文重点研究精制液的冷冻储存的质量稳定性。

1 仪器与试药

美国先德公司生产的PC－2000高效液相色谱仪、SSI－3000紫外检测器、ST－400柱温箱、10μL微量进样器、减压干燥器、SB－3200型超声波清洗器、ADS－135型十万分之一分析天平、JYP－2架盘天平。

牛磺熊去氧胆酸对照品（有中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号110816－200906）、沈阳华东生产的色谱级甲醇、磷酸二氢钠、0.45μm有机滤膜、水为重蒸馏水。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇－磷酸二氢钠溶液（0.03mol／L）（68∶32）为流动相，并用磷酸调p H值为4.4，检测波长为210nm，柱温为40℃，流速为1.0m L／min。理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算，应不低于2500。

2.2 对照品溶液与供试品溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备。取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解并定量稀释制成每1m L含1mg的溶液，即得（相当于牛磺熊去氧胆酸0.9578mg）。

2.2.2 供试品溶液的制备。取引流熊胆粉精制品适量（相当于熊胆粉0.12g），精密称定，置50m L量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率300W，频率50k Hz）10min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，收集续滤液，即得。

2.2.3 测定方法。精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μL，分别注入液相色谱仪，测定，即得。

2.3 稳定性试验

取供试样品溶液，定时（0、3、6、9、12、18、24h）进样测定，保留峰面积积分值分别为：529771、544174、549652、539884、529554、543211，平均值为543707，RSD＝1.51%。测定结果表明，样品溶液在24h内基本稳定。

2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μL，重复进样6次，保留峰面积积分值分别为：334463、333690、323125、330456、337473、331841，平均值为331841，RSD＝1.65%。符合国家标准要求。

2.5 线性关系的考察

精密吸取牛磺熊去氧胆酸对照品溶液（1.0mg／m L）0.5，1.2，5.5，10，20μL，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值为纵坐标，以牛磺熊去氧胆酸对照品进样量（μL）为纵坐标，绘制保准曲线，回归方程为：Y＝498.7X－ 0.0752，r＝0.9974。结果表明牛磺熊去氧胆酸进样量约在4.2～12.5μL呈良好的线性关系，最小检出限（信噪比≥3）为0.56μL。

2.6 重现性试验

取同一批次的引流熊胆粉精制品，依照上述处理方法，按前述测定方法重复测定样品6次，牛磺熊去氧胆酸含量为11.21%、11.01%、11.07%、10.89%、10.76%、10.94%，平均为10.98mg／m L，RSD＝1.41%，结果表明此法重现性良好。

2.7 加样回收率试验

精密吸取已知含量的同一批引流熊胆粉精制品20m L，精密加入牛磺熊去氧胆酸对照品溶液适量，按照样品溶液处理的制备方法操作，测定其含量，并计算回收率为97.56%、97.01%、98.11%、97.22%、96.98%、98.46%，平均为97.56%，RSD＝0.63%。

2.8 样品测定结果

分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，依上述色谱条件，以外标法计算含量，测定样品。

2.8.1 常温下引流熊胆粉精制品含量测定

表1 常温下引流熊胆粉精制品含量 mg·m L－1

2.8.2 不同温度条件储存下的引流熊胆粉精制品，储存时间30天后，在常温条件下进行含量测定及无菌检查。

表2 不同温度下储存对含量的影响

续表1

3 讨论

3.1 引流熊胆粉精制品储存过程中温度对含量的影响。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同储存温度条件下，对引流熊胆粉精制品储存30天后，在常温条件下进行含量测定，确定引流熊胆粉精制品储存温度。3.2 引流熊胆粉精制品储存过程中温度对无菌的影响。在20℃、0℃、－5℃、－10℃、－15℃、－20℃、－22℃、－24℃、－26℃、－28℃、－30℃等不同储存温度条件下，对引流熊胆粉精制品储存30天后，依据中华人民共和国药典10版，附录ⅩⅢB无菌检查法进行检查，在常温条件，进行无菌检测，在硫乙醇酸盐流体培养基（Thioglycollate Medium）、改良马丁培养基（Modified Martin Medium）应无细菌和真菌检出，为适宜的储存温度。

3.3 熊胆粉为不规则的碎片、颗粒或粉末，黄色至深棕色，半透明，有玻璃样光泽，易吸潮结块有粘牙感，腥臭，味极苦。精制液位浅黄色液体，精制后不含蛋白质及粘液质等杂质，无腥臭味。对改变制剂的颜色、气味、澄明度、避免不良反应发生有重要意义。

3.4 经以上实验结果，利用高效液相色谱法确定引流熊胆粉精制品测定的色谱条件和适用性试验。利用高效液相色谱法测定引流熊胆粉精制品的含量具有专属性强及结果准确等特点。经过实验数据的统计，确定引流熊胆粉精制品长期存储的储存条件，确保应用引流熊胆粉精制品的制剂的稳定性，为保证制剂质量提供依据。

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