脓毒症休克合并急性肾损伤早期诊断研究

玉章锋 秦海东 鲍磊 邓会标 张铮

脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征(SIRS)，严重者可引起脓毒症休克(septic shock)，甚至多器官功能障碍综合征(MODS)。急性肾损伤(AKI)是入院患者特别是ICU老年患者的常见并发症，其发生率大约占到全部入院患者的1%～7%，占到ICU患者的1%～25%［1-2］。老年高血压患者介入术后AKI发生率明显增高［3］。在ICU病房中AKI患者的病死率为50%～70%。脓毒症是AKI发生发展的危险因素之一，在发生脓毒症的患者中几乎有一半以上发生AKI。另外，AKI可以增加脓毒症休克患者的短期死亡率［4-5］。因此，肾脏功能在脓毒症和脓毒症休克患者疾病的发生发展和预后的过程中起着至关重要的作用。

截至目前，血肌酐(SCr)和尿量仍是诊断AKI唯一可靠的检测指标，也是AKI分期的依据。但是，SCr诊断AKI的敏感性和特异性不强，且易受到多种因素的影响，因此需要寻找新的诊断AKI的早期生物标志物。本实验通过建立脓毒症休克诱发AKI的动物模型，观察脓毒症休克合并AKI对肾脏功能的影响并探讨新型生物标志物在脓毒症休克合并AKI诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备雄性新西兰大白兔70只，体质量2.0～2.5 kg，由南京医科大学动物实验中心提供，按随机数字表法分为对照组和模型组，各组又分别选取0、3、6、9、12 h时间点取材，每组7只。参照全竹富等［6］改进的盲肠结扎穿孔术联合静脉注入内毒素制备脓毒症休克合并AKI动物模型：予20%乌拉坦3 ml/kg麻醉后，在无菌操作下取中、下腹部正中切口，长约8 cm，找出盲肠后模型组在距盲肠末端5 cm处用4号线结扎，并在盲肠游离末端戳孔，直径0.5 cm，同时结扎其供应血管，完成后将盲肠放回腹腔原位，关腹。右股静脉置管补液，左颈动脉插管测动脉压(ABP)，留置导尿管，术后待血压稳定15 min后予大肠杆菌内毒素(LPS，血清型O55B5，SIGMA公司)600 μg/kg静脉推注(对照组给予等量生理盐水)，时间约15 min。以平均动脉压降至基础血压值的60%视为达到休克标准，休克造模成功后即以1 ml/(kg·min)林格氏液进行复苏，以平均动脉压恢复至75 mmHg为早期休克复苏的标准。实验过程符合动物伦理学标准。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 兔肾组织光镜检查：各组分别取皮质、髓质和皮髓质交界处组织标本作常规HE染色，在100倍及400倍下观察肾组织病理损伤程度。

1.2.2 兔肾组织透射电镜检查：各组分别取肾组织标本作电镜检查。

1.2.3 兔肾功能检查：各组新西兰大白兔分别于休克后0、3、6、12 h点股静脉取血，分离血清，经自动生化分析仪检测SCr、血尿素氮(BUN)。

1.2.4 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)和白介素18(IL-18)的测定：采用酶联免疫吸附(ELISA)双抗体夹心法，按试剂盒说明操作，酶标仪测定。

1.3 统计学处理所有数据采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差(¯x±s)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用scheffe检验。以P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜造模组显示在6、12 h均有皮、髓质交界区的肾小管变性及局灶性坏死，间质广泛水肿，多种炎细胞浸润，并可见远端肾小管和集合管有以淡红色均质蛋白为主的管型及肾小管扩张;对照组则病理改变较轻，可见间质少有水肿，有较少的炎细胞浸润，偶可见空泡变性和嗜酸性变。

2.2 透射电镜造模组6 h点可见肾小球毛细血管内皮细胞有不同程度肿胀，内质网扩张，空泡变性，核染色质边集，微绒毛粘连倒伏、脱落;12 h点可见内皮细胞肿胀，胞质增多，线粒体增生模糊，近曲小管上皮细胞线粒体增生模糊或减少，内质网扩张，空泡变性;对照组6 h点见内皮细胞不同程度肿胀，空泡化不明显，系膜细胞肥大增生，足细胞胞质增多，肥大增生，肾小管管腔内出现多种形态的脱落物。

2.3 模型组与对照组间检测指标的比较造模组各时间点生化检测指标均高于对照组;随时间延长，造模组各项生化检测指标逐渐升高;与对照组比较，造模组12 h时间点SCr水平明显升高(P＜0.05);BUN各时间点比较无统计学差异(P＞0.05);与对照组比较3 h时间点NGAL即明显升高(P＜0.05);KIM-1和IL-18于9 h时间点开始明显升高(均P＜0.05)。见表1。

3 讨论

脓毒症休克也称感染性休克，是由革兰阴性或阳性细菌、立克次体、霉菌、病毒等病原微生物及其毒素等产物引起的人体有效循环血量急剧减少，组织血液灌注严重不足从而导致全身各重要器官和细胞的功能代谢障碍及结构损害的一种急危重症。肾脏是脓毒症和脓毒症休克最易受累的器官之一，AKI又是影响脓毒症和脓毒症休克患者疾病发生发展和预后的重要因素，然而目前对ICU老年患者进行脓毒症AKI的流行病学研究的资料较少［7-8］。两个多中心研究显示，在ICU所有发生AKI的患者中有46%～48%是由脓毒症和脓毒症休克引起的［9-10］。

AKI最初被称为ARF，它概括了从肾功能微小改变到最终肾功能衰竭整个过程，准确地反映了疾病的基本性质，对早期诊断和治疗具有积极的意义［11］。ARF是继恶性肿瘤、肺部感染和心血管疾病之后引起老年糖尿病患者死亡的主要原因之一［12］。传统的血清学指标SCr缺乏敏感性和特异性，不能准确地反映肾功能的变化，亦不能反映出肾损伤的性质和部位。本研究通过对NGAL、KIM-1和IL-18的检测以及与SCr、BUN对比发现，NGAL在AKI发生发展的过程中开始升高的时间要明显早于SCr、KIM-1和IL-18开始升高的时间亦要早于SCr，另外NGAL的升高要早于病理损伤结果，SCr的明显改变则迟于病理损伤的出现。

表1 2组间各时间点检测指标的比较(±s，n=7)

表1 2组间各时间点检测指标的比较(±s，n=7)

注：与对照组比较，*P＜0.05;与同组术后0 h比较，▲P＜0.05

组别时间Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)NGAL(μg/L)KIM-1(μg/L)IL-18(ng/ml)模型组术后0 h28.76±4.513.40±0.7527.05±5.415.35±1.5 4056.11±5.26 342.55±7.73术后3 h34.68±5.714.19±1.3189.17±7.18＊▲5.84±1.2443.84±5.32术后6 h50.20±12.553.96±1.14115.54±8.20＊▲6.12±1.4346.96±4.43术后9 h56.70±19.016.13±3.36283.81±15.05＊▲31.98±8.42＊▲102.52±9.58＊▲术后12 h165.20±20.42＊▲6.17±3.99311.57±7.57＊▲55.02±8.23＊▲210.23±20.33＊▲对照组术后0 h27.92±1.243.48±0.3629.91±1.705.47±0.8243.54±3.67术后3 h28.79±0.984.01±0.6529.93±3.695.87±0.8744.70±4.14术后6 h29.43±1.253.59±0.4132.27±3.986.93±0.2447.50±5.96术后9 h30.47±1.213.97±0.7234.97±2.327.28±0.6355.77±8.34术后12 h32.13±2.693.74±0.3634.63±4.787.90±1.

NGAL是一种具有铁离子螯合转运功能的脂质蛋白，其体内表达水平可以反映肾小球滤过屏障、近端肾小管的重吸收功能和远侧肾单位的损伤情况。Mishra等［13］的研究发现NGAL在顺铂诱导的AKI 3 h后即可检测到，而96 h后SCr才检测到明显升高。心脏介入术后发生AKI的患者在手术后1～2 h血、尿NGAL浓度明显升高，比SCr明显升高要早48～72 h，血液中NGAL检测特异性为74%，敏感性达90%，尿液中NGAL检测特异性为80%，敏感性76%，可见其与AKI的发生发展密切相关［14-15］。本实验中，NGAL水平在休克术后3 h开始明显升高，这与上述研究结果相一致，但同时应该指出，NGAL是通过肾小球滤过的，其在炎性及感染条件下也会升高，因而将血浆及尿液NGAL水平用于诊断脓毒症AKI及脓毒症休克引起的AKI还需要进一步研究。IL-18是一种促炎症细胞因子，一般在近端小管产生和释放。有实验证明，在缺血性肾损伤中，在Scr尚未明显升高前就能在近端小管大量检测到IL-18，其特异性和敏感性均超过90%，因此，尿IL-18水平对AKI的诊断是一个很有价值的工具。本研究结果显示，IL-18在术后9 h即明显升高，此结果比SCr和BUN提前约3 h，而此时肾脏的病理损伤尚未明显出现，如此时给予干预措施将明显改善患者的预后。KIM-1是一种由334个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，在正常肾组织中几乎不表达，但是在缺血及肾毒性损伤的肾小管上皮细胞中却呈高表达状态。Han等［16］发现，在40例儿童行心脏手术的病例对照研究中20例患者发生了AKI，20例没有发生，其尿液KIM-1水平明显不同，其12 h点预测AKI的AUC为0.83，此时其他肾功能检测指标(肌酐清除率、BUN等)均无明显改变。本实验中，KIM-1亦于9 h点开始明显升高，与IL-18临床意义相似，但其相对局限于缺血及肾毒性损伤疾病中，故有临床鉴别意义。

综上所述，良好的生物学标志物应该是能够客观地被测量或评价的指标，并且可以用于疾病病理过程［17］。本研究结果显示NGAL、IL-18和KIM-1可用于检测AKI的早期诊断和预测，其敏感性和特异性均优于传统的SCr等生物学指标，但其还仅限于实验室和动物实验中，进一步的临床推广和商业开发还有待于大规模临床验证和多中心的队列研究。

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