灯盏花中灯盏花乙素的提取与高效液相色谱分析

许志刚，胡劲召，单法辉，杨保民，刘智敏，字富庭

(1.昆明理工大学理学院，云南 昆明650093;2.琼州学院理工学院，海南 三亚572022)

0 引言

灯盏花为菊科飞蓬属植物短亭飞蓬的全草，性寒、味微苦，具有散热解表、活血化瘀、通经活络、消炎止痛等功效，临床上用于心脑血管疾病、糖尿病肾病、肝硬化、皮肤病的治疗［1］.其主要分布在云南、广西、四川、贵州等地，由于自然分布的灯盏花数量有限，加之现代的大规模开发，野生灯盏花的数量已十分稀少.云南省已在楚雄、丽江、红河等地进行大规模种植和研发，并将其列为重点开发中药材.

灯盏花的主要有效成分为灯盏花素，包括灯盏花乙素和灯盏花甲素，两者的化学结构式如图1所示.灯盏花素中绝大多数为灯盏花乙素，灯盏花制剂广泛应用于临床，已有相关的药理研究［2］、动力学研究［3］、生物有效性［4］、质量控制［5］、分析方法［6］等方面的报道.灯盏花乙素的提取方法有溶剂浸提法［7－8］、索氏提取法［9－10］、超声提取［11］和微波提取［12］等.溶剂提取法具有操作简便、快捷的特点.本文采用溶剂提取法制备灯盏花乙素提取液，优化提取条件，结合高效液相色谱进行定量分析，并对分析方法进行评价，该方法操作简便、快速、稳定，适合灯盏花乙素的提取与快速分析.

图1 灯盏花乙素和灯盏花甲素的化学结构式

1 实验部分

1.1 仪器Dionex UltiMate－3000高效液相色谱仪，配备DAD检测器和C18色谱柱(5 μm，4.6×250 mm);N－1001型旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司;TG16－WS台式高速离心机，湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司;BS224S电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司;SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司;UPT－I－10超纯水机，成都超纯科技有限公司;Time ultrasonic超声波清洗器，深圳市时代超声设备有限公司;水浴回流装置一套.

1.2 试剂灯盏花，购于昆明市菊花村中药市场;灯盏花乙素标准品，购于贵州迪大科技有限责任公司;甲醇为色谱纯;其他化学试剂为分析纯;实验用水为超纯水，试样在色谱分析前经0.45 μm滤膜过滤.

1.3 灯盏花乙素的提取及条件优化灯盏花的提取方法参考文献［13］，灯盏花全株样品破碎后过60目筛，用75%乙醇进行二次水浴回流提取，得到的二次提取液含有较多的杂质，这些杂质的存在可能会对灯盏花乙素的HPLC定性和定量分析带来影响，所以试验分别对除杂溶剂的种类和水沉除杂的时间进行了考察和优化.

1.4 色谱分析条件采用高效液相色谱对灯盏花乙素进行定量分析，流动相为甲醇:0.1%磷酸(v/v，40/60);流速0.9 mL/min，进样体积均为20 μL;检测波长335 nm，柱温25℃.

2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

2.1.1 除杂溶剂优化取20 g灯盏花粉末，经水浴回流得到灯盏花的二次提取液200 mL，平均分成四份，分别用石油醚、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯对提取液进行萃取分离纯化处理，萃取两次，每次用量50 mL，收集水相，10000 r/min高速离心5 min，清夜用0.45 μm滤膜过滤，然后进行HPLC分析.经四种溶剂除杂后的色谱图如图2所示.结果表明:提取液经乙酸乙酯和正丁醇萃取纯化后，干扰物质基本去除，但灯盏花乙素的含量也损失较多，对定量分析不利;氯仿和石油醚的除杂效果不佳，和不经溶剂除杂的效果基本一致.考虑到杂峰并不影响灯盏花乙素的定量分析，实验采用灯盏花二次提取液直接进行色谱分析.

图2 灯盏花提取液溶剂除杂效果对比图

2.1.2 水沉时间优化

取10 g灯盏花粉末，经水浴回流得到的乙醇相灯盏花初提取液，旋转蒸发至水相，加入约4倍的水定容，分别室温放置0 h、24 h、48 h，进行水沉.水沉后水相旋转蒸发，换75%乙醇作溶剂，10000 r/min高速离心5 min，清夜用0.45 μm 滤膜过滤，然后进行HPLC分析.比较其分离纯化效果，色谱图如图3所示.结果表明:水沉处理具有一定的除杂效果，但水沉会损失大量的灯盏花乙素，不利于灯盏花乙素的定量分析.灯盏花损失可能是由于水沉过程析出固体可见物，吸附了溶液中的灯盏花乙素.因此，实验中得到的提取液不经水沉处理.

图3 水沉时间对灯盏花乙素含量的影响

2.2 灯盏花乙素标准品线性关系考察配制系列灯盏花乙素标准溶液，进行高效液相色谱分析，绘制峰面积－浓度标准曲线，线性方程为Y=0.955+1.11X，相关系数 r=0.9999，线性范围为0.10 －500 mg/L，检出限为7.0 μg/L.

2.3 高效液相色谱法测定灯盏花乙素含量准确称取1 g灯盏花样品，按照优化的方法进行提取，并进行高效液相色谱分析，通过建立的色谱方法进行定量分析，得到灯盏花样品中灯盏花乙素的含量为1.0%，平行测定5次，相对标准偏差RSD为3.0%.

3 结论

通过75%乙醇回流提取的方法制备灯盏花提取液，并经过除杂溶剂和水沉时间的优化，建立了灯盏花样品中灯盏花乙素的快速、简便的提取方法，结合高效液相色谱实现定量分析，方法的线性方程为Y=0.955+1.11X，相关系数 r=0.9999，线性范围为 0.10 －500 mg/L，检出限为 7.0 μg/L，灯盏花样品中灯盏花乙素的含量为1.0%，平行测定5次的相对标准偏差为3.0%.该方法操作简便、快速、稳定，适合灯盏花乙素的提取与快速分析.

［1］高帅荣，万屏.灯盏花素临床应用进展［J］.云南中医中药杂志，2009，30(3):67－68.

［2］张峻，李雪松，张卫东.中药灯盏花化学成分与药理活性研究进展［J］.药学实践杂志，2002，20(2):103－107.

［3］丁存刚，葛庆华.灯盏花素药物动力学研究进展［J］.中国医药工业杂志，2006，37(2):137－139.

［4］沈倩，李秀琴.灯盏花素生物有效性探讨［J］.首都医药，2006，13(24):32－33.

［5］巢艳红，徐希明，余江南.灯盏花素新剂型及其质量控制的研究进展［J］.中国药事，2010，24(7):711－715.

［6］许志刚，刘智敏，杨保民，等.灯盏花中灯盏花乙素的提取与分析方法探讨［J］.昆明学院学报，2011，33(6):81－84.

［7］孙云峰，吴品昌，赵龙山，等.灯盏花提取物HPLC指纹图谱研究［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13(1):188－189.

［8］张旭，耿伯显，陈玲玲，等.灯盏花HPLC指纹图谱的研究［J］.中药与天然药物，2003，34(6):270－272.

［9］陈楚萍，王健壮，周晔.灯盏花颗粒中野黄芩苷的含量测定［J］.广东药学院学报，2010，26(3):279－282.

［10］胡倩，戴霖霖，王玲，等.灯盏花素的提取与分离工艺研究［J］.化学与生物工程，2009，26(4):58－60.

［11］张俭，杨艳梅，肖雅元，等.灯盏花黄酮超声波辅助提取工艺研究［J］.江苏农业科学，2008，16(4):212－213.

［12］Gao M，Huang W，Chowdhury M，et al.Microwave－assisted extraction of scutellarin from Erigeron breviscapus Hand－Mazz and its determination by high－performance liquid chromatography［J］.Anal.Chim.Acta，2007，591(2):161 －166.

［13］楼云雁，石森林，葛卫红，等.正交试验法优选灯盏花素的提取工艺［J］.浙江中医杂志，2006，41(6):353－354.