广西地区人群5个X-STR位点的多态性分析

周峻荔，韦红英，吴 华，胡艳玲，梁伟玲

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

短串联重复序列(STR)在人群中分布广泛，具有高度多态性，突变率低，其重复序列短，易于PCR扩增，近年来成为血友病A家系连锁分析中最常用的DNA遗传标记［1］。由于STR存在地区和民族差异性，2010年7月～2011年7月，本文选择FⅧ基因内外的 5个 X-STR位点(F8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108)，运用荧光标记毛细管电泳自动检测的方法，对广西地区100例无关女性个体进行STR多态性分析，获得相关的遗传学数据，为该地区血友病A携带者诊断和产前诊断提供可靠信息。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取无血缘关系的健康女性100例，来源于广西医科大学第一附属医院儿童保健科门诊，年龄(7.2±4.33)岁。个体三代均为广西人群，民族为汉族或壮族。

1.2 方法

1.2.1 荧光标记PCR 抽取受试者的静脉血2 mL，EDTA抗凝，运用血液DNA提取试剂(Qiangen)，按照试剂说明书步骤提取DNA，提取的DNA通过紫外分光光度仪测其浓度和含量。引物合成(上海生工)参见文献［2，3］，引物序列见表1。PCR反应的总体积为20 μL，MIX 10 μL，模板1 μL，上下游引物各取0.4 μL(10 μmol/L)，运用ABI 2720 PCR仪进行PCR扩增，扩增条件为:预变性95℃5min，变性95℃ 30 s，退火60℃ 45 s，延伸72℃ 5 min，30个循环后，再延伸72℃ 5 min。

表1 各位点的引物序列及荧光标记

1.2.2 毛细管电泳和STR分型 去离子甲酰胺、GeneScan-500［ROX］分子量标准物、PCR混合产物按9∶0.6∶0.6混合均匀，离心，置95℃变性3 min，立即置冰上10 min，运用ABI 3100基因分析仪对PCR产物进行毛细管电泳，DNA基因分型采用CeneScan及Genotyper软件。

1.2.3 统计学方法 采用PowerStatsV12.xls软件计算5个STR位点的相关遗传学数据;通过计算χ2值，应用SAS软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度的检测(P值＞0.05)［4］，计算公式:χ2=(观察杂合率－期望杂合率)2÷期望杂合率。P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 STR分型结果 见图1。

2.2 STR位点检测结果 5个STR位点的基因片段长度及其等位基因频率见表2。

图1 毛细管电泳图

2.3 STR位点的相关遗传学数据 多态信息量(PIC)、个体识别能力(DP)、遗传标记杂合率(H)见表3。

表3 STR位点的遗传学数据

2.4 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检测结果见表4。

表4 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检测

3 讨论

血友病A是最常见的X染色体隐性遗传出血性疾病，近年来国内外部分学者多选用荧光PCR同时扩增数个STR位点的方法，以达到快速诊断血友病A的目的。目前已知在FⅧ基因内外存在14个STR位点，6个位于基因内，在国内外研究中最为常用的两个位点为内含子13(F8Int13)和内含子22 (F8Int22)［5］，已被选入我们的课题研究中。在迄今的报道中，F8Int13的最大杂合率为91%［6］，F8Int22的最大杂合率为79%［7］;同时我们还选定了基因外的3个STR位点(DXS1073、DXS1108、DXS9901)，其中DXS9901和DXS1073在中国上海汉族人群中存在较为理想的杂合率［2］。

表2 各位点的等位基因及其频率

STR存在地域和民族差异性，壮族和汉族为广西最大的2个民族，我们选取广西地区100例壮、汉族无关个体女性作为研究对象，对其FⅧ基因内外的5个STR位点进行了遗传多态性分析，结果显示，F8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108的H分别为42%、56%、57%、78%、40%，其中F8Int22、F8Int13这两个位点的 H与国内报道一致［2，8，9］，但低于国外报道［6，7］。DXS1073、DXS9901的H与上海汉族人群相近。DXS1108在国外的研究中显示有较高的H［3］，但在中国地区的H低，考虑这种差异性不仅来自于地域和民族，还可能与样本数量和遗传背景有一定关系。

一般来说，STR的H越高，其PIC越丰富［9］，F8Int22、F8Int13、DXS1073、DXS9901、DXS1108的PIC值分别为0.43、0.59、0.59、0.82、0.42。通过计算χ2值，5个 STR的基因型频率均符合 Hardy-Weinberg遗传平衡，可用于群体的遗传学分析。其中F8Int13、DXS1073、DXS9901的H较高，且存在较为理想的PIC，其对应的DP分别为0.819、0.824、0.945，均达0.8以上，3个位点的联合DP(TDP)为0.982，其计算公式为:TDP=1－(1－DP1)(1－DP2)…(1－DPn)［10］。

本研究结果显示，F8Int13、DXS1073、DXS9901这3个位点具有高度遗传性，可选为广西地区血友病A家系连锁分析的遗传标记位点，这不仅对今后广西地区血友病A的基因诊断、产前诊断方面有着重要意义，而且在血友病A的无创性产前诊断、移植前基因诊断，以及在X连锁的单基因遗传病的诊断上也有一定的借鉴价值。

［1］朱春江，龙桂芳.微卫星及在血友病A基因诊断中的研究进展［J］.华夏医学，2006，19(3):595-597.

［2］Fang Y，Wang XF，Dai J，et al.A rapid multifluorescent polymerase chain reaction for genetic counselling in Chinese haemophilia A families［J］.Haemophilia，2006，12(1):62-67.

［3］Harraway JR，Smith MP，George PM.A highly informative，multiplexed assay for the indirect detection of hemophilia A using fivelinked microsatellites［J］.J Thromb Haemost，2006，4(3):587-590.

［4］Butler JM.基本遗传学原理、统计学及概率［M］//侯一平，刘雅诚.法医DNA分型-STR遗传标记的生物学、方法学及遗传学.北京:科学出版社，2007:331-342.

［5］Machado FB，Medina-Acosta E.High-resolution combined linkage physical map of short tandem repeat loci on human chromosome band Xq28 for indirect haemophilia A carrier detection［J］.Haemophilia，2009，15(1):297-308.

［6］Lalloz MR，McVey JH，Pattinson JK，et al.Haemophilia A diagnosis by analysis of a hypervariable dinucleotide repeat within the factor VⅢgene［J］.Lancet，1991，338(8761):207-211.

［7］Pandey GS，Phadke SR，Mittal B.Carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A in North India［J］.Int J Mol Med，2002，10(5):661-664.

［8］Liang Y，Zhao Y，Yan M，et al.Prenatal diagnosis of haemophilia A in China［J］.Prenat Diagn，2009，29(7):664-667.

［9］褚玉新，胡朝晖，王晓春，等.广东地区正常人群DXS15，CA13，CA22位点多态性研究［J］.中国实验血液学杂志，2009，17(6): 1569-1572.

［10］李彩霞，凌凤俊，涂政，等.犬的三个STR基因座遗传多态性［J］.动物医学进展，2002，23(5):80-81.