液相色谱－串联质谱法测定饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物

应永飞，朱聪英，韦敏珏，陈慧华，周 炜，林仙军，汪以真

（1.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058；2.浙江省畜产品质量安全检测中心，浙江 杭州 310020）

液相色谱－串联质谱法测定饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物

应永飞1，2，朱聪英2，韦敏珏2，陈慧华2，周 炜2，林仙军2，汪以真1

（1.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058；2.浙江省畜产品质量安全检测中心，浙江 杭州 310020）

采用高效液相色谱－电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS-MS）在多反应监测（MRM）模式下，建立饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物（三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺）的快速确认检测方法。试样中的三聚氰胺及其类似物经甲酸－乙腈溶液提取，氮气吹干，用定容液溶解后，进行液相色谱－串联质谱测定，采用色谱保留时间和质谱碎片离子丰度比定性，以15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸作为内标进行定量。采用正离子扫描和负离子扫描的方式进行仪器方法学研究，确定丰度比最高的两对离子作为监测离子，进行MRM模式定性定量分析。该方法的检出限（LOD）为0.25～0.50mg/kg；在5.0～500.0μg/L的线性范围内，相关系数r均大于0.999。在0.5～2.0mg/kg的添加水平上，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的回收率为61.4%～115%，相对标准偏差不大于12.6%。

液相色谱－串联质谱法（LC-MS/MS）；饲料；土壤；三聚氰胺；类似物

三聚氰胺（melamine，MEL）是一种重要的化工材料，常用于制造三聚氰胺树脂，是建筑业中常用的防火材料，与饲料行业毫不相干，但是2007年3月发生在美国的数起饲料致宠物死亡事件使两者联系在一起［1］。2008年9月我国又发生了在婴幼儿奶粉中添加三聚氰胺的事件，一时间由三聚氰胺造成的食品安全问题引起了广大人民群众的恐慌。有证据显示，三聚氰胺在哺乳动物体内并不能被肝脏进行生物转化代谢，但当三聚氰胺与其类似物三聚氰酸（cyanuric acid，CYA）同时存在时，二者能够依靠分子结构上的氢氧基与氨基之间形成水合键（氢键），从而将二者连接起来，这种连接可以反复进行，最终形成一个网格结构，从而形成肾结石和尿结石等，造成泌尿系统功能障碍［1－2］。三聚氰胺类似物除三聚氰酸外，还包括三聚氰酸一酰胺（ammelide，AMD）、三聚氰酸二酰胺（ammeline，AMN）等，这些化合物均可以相互作用而形成网状物，造成结石，同时监测三聚氰胺及其类似物的污染情况比仅仅监测三聚氰胺更具现实意义。完善三聚氰胺污染调查检测技术体系，必须了解饲料污染情况和导致饲料三聚氰胺污染的原因，作为植物源性饲料生长基本要素的土壤有可能是造成污染的原因之一。因此，为了进一步摸清动物源食品中三聚氰胺的污染源和污染途径，建立饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物的同时、快速检测技术尤为迫切。

目前，国内外文献中尚未见同时检测饲料和土壤中4种三聚氰胺及其类似物的方法，已有的检测方法主要以三聚氰胺或三聚氰胺和三聚氰酸同时检测研究为主［3－4］。农业行业标准 NY/T1372建立了饲料中三聚氰胺的高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱－质谱法（GC/MS）［5］；李爱军等［6］建立了液相色谱－串联质谱法（LCMS/MS）测定饲料中三聚氰胺；Ge等［7］建立了LC-MS/MS法测定土壤中三聚氰胺。同时检测4种三聚氰胺及其类似物主要以生鲜乳或动物源性食品为主，主要有毛细管胶束电动色谱法（MEKC）［8］、GC/MS 法［9－10］和 LC-MS/MS法［11－13］等，这些方法较好的解决了4种三聚氰胺及其类似物的检测问题。但由于未建立饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物的同时检测技术，无法进行该系列样品准确的定性和定量分析，从而使污染源调查工作不能深入开展，因此完善三聚氰胺污染源检测技术体系尤为必要。GC/MS法和LC-MS/MS法因集高效分离和多组分定性、定量于一体，成为近年来研究三聚氰胺及其类似物的主要方法，特别是LC-MS/MS法无需衍生等繁琐的前处理过程，已成为三聚氰胺及其类似物检测的主要手段。本研究采用LC-MS/MS法检测饲料和土壤中三聚氰胺及其类似物，对样品前处理方法和仪器分析条件进行系统优化，为开展三聚氰胺及其类似物的污染源调查、系统了解其环境迁移行为提供全面的检测技术。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

Waters Alliance 2695液相色谱仪-Micromass Quattro Micro三重四极杆串联质谱仪：美国Waters公司产品，配MassLynx V4.0软件；3k30型冷冻离心机：美国Sigma公司产品；MS2minishaker旋涡混匀器：IKA公司产品；AG-285电子天平：Mettler公司产品；12位水浴型氮吹仪：美国Organomation公司产品。

三聚氰胺：购自国家标准物质研究中心；三聚氰酸标准品（纯度大于98.0%）：Dr.Ehrenstorfer公司产品；内标物15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸（纯度均大于99.0%）：WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH 产品；甲醇、乙腈（HPLC级）：Merck公司产品；甲酸（纯度为99%）：Acros Organics公司产品；实验用水为milli-Q超纯水；其它试剂均为分析纯。

分别精密称取10mg三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺于100mL容量瓶中，三聚氰胺、三聚氰酸用水溶解后定容；三聚氰酸一酰胺、三聚氰酸二酰胺用2%氨水溶液溶解后定容，置于0～4℃冰箱中保存。分别吸取适量的各标准品储备液置于同一容量瓶中，用甲醇溶解制成1.0mg/L标准品工作液。内标溶液配制成1.0mg/L的15N3－三聚氰胺、13C3－三聚氰酸工作液。

1.2 样品前处理

称取2.0g（精确至0.001g）试样于50mL容量瓶中，加40mL提取液（取500mL 2.5%甲酸溶液，用乙腈定容至1 000mL），加盖，振荡60s，于超声波清洗器中超声提取20min；取出冷却后，定容至刻度，摇匀；取5mL上清液至离心管中，以14 000r/min离心20min；准确量取1.0mL上清液，加50μL内标工作液，涡旋混匀，50℃下氮气吹干；加定容液（取100mL 0.2%甲酸溶液，用乙腈定容至1 000mL）定容至1.0mL，充分溶解，溶解液过0.22μm微孔滤膜后，进行LC-MS/MS分析。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis HILIC柱（2.1mm×150mm×3.5μm）；柱温30℃，进样量20μL。流动相组成及配比列于表1。

表1 流动相组成及配比Table 1 Gradient mobile phase for HPLC

1.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式和正离子模式分段进行采集，离子源温度110℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气和锥孔气为N2，脱溶剂流速600L/h，锥孔气流50 L/h，光电倍增器电压650V。三聚氰胺采用正离子监测方式，毛细管电压3.0kV，萃取电压2 V；三聚氰酸采用负离子监测方式，毛细管电压3.3kV，萃取电压2V。碰撞气为高纯氩气，控制碰撞室的压力为0.3Pa。采用MRM多反应监测方式。母离子（Q1）/子离子（Q3）离子对均设为单位分辨，各离子对的驻留时间均为100 ms，具体监测条件列于表2。

2 结果与讨论

2.1 质谱定性定量分析

三聚氰胺及其类似物属于极性化合物，水溶性较好，其中三聚氰酸存在酮式和烯醇式两种互变异构体，以烯醇式为主。由于三聚氰胺含有氨基，容易得到质子，可采用ESI＋模式监测准分子离子［M＋1］＋，而三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺含有羟基，容易失去质子，采用ESI-模式监测准分子离子［M－1］-。在优化三聚氰酸二酰胺时，发现ESI＋和ESI-模式下各有一对离子的响应值较高，而另外一对离子的响应值均较低，无法满足检测需要，为达到欧盟2002/657/EC［14］规范关于残留检测化合物定性的要求，采用同时监测ESI＋和 ESI- 模式下的m/z128.0/86.0和m/z126.0/83.0离子对，得到了最大的检测灵敏度。本标准参考FDA［13］的方法进行同时检测，分段采集，以20mmol/LV（甲酸铵）∶V（乙腈）＝50∶50的溶液为基准流动相，采用流动注射泵连续进样，对三聚氰胺及其类似物和两种内标物的质谱条件进行优化，在正离子模式和负离子模式下进行全扫描，以选择适当的分子离子峰和电离方式。根据不同化合物的响应和保留时间差异，设置2个通道分两段进行监测。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，优化参数，从而相应的确定了各种药物在多反应监测模式下信号采集的特征离子对，列于表2。子离子扫描图示于图1。采用正离子模式监测三聚氰胺和三聚氰酸二酰胺（m/z128.0/86.0），负离子模式监测三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺（m/z126.0/83.0），并对离子源和碰撞能量等相关参数进行优化，鉴别点（IPs）均能满足欧盟2002/657/EC的决议要求［14］。

表2 三聚氰胺及其类似物的MRM监测条件Table 2 MRM optimization conditions of melamine and its analogues

图1 三聚氰胺及其类似物与内标物的子离子扫描图Fig.1 Daughter scan of melamine and its analogues

2.2 液相色谱条件的优化

由于三聚氰胺及其类似物的极性较强，采用亲水反应离子交换色谱柱（HILIC柱）可以实现很好的分离，因此得到广泛应用。比较了 Waters XBridgeTMAmide柱（4.6mm×150mm×5.0μm）、Waters XBridgeTMHILIC柱（4.6mm×150mm×3.5μm）、Agilent Rx Sil（2.1mm×150mm×5.0μm）、Waters Atlantis HILIC柱（2.1mm×150mm×3.0μm）和 Merck ZICHILIC柱（2.1×150mm×5μm）等一系列分离色谱柱，发现采用改良后FDA色谱条件，氨基柱的分离效果较差，而在HILIC色谱柱上均可以得到较好的色谱峰型和色谱保留时间，响应值差别不大，均可满足要求，因此选用 Waters XBridgeTMHILIC柱作为分离柱进行研究。实验过程中，流动相的比例对三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的影响特别显著，当流动相的梯度比例由（80/20）变为（60/40）时，目标物的保留时间基本一致，但灵敏度降低5倍以上。因此，本方法最终确定了列于表1的液相色谱条件，此时的MRM色谱图示于图2。由图2可以看出，目标物得到了满意的分离及响应值。样品定容液是影响三聚氰酸峰型和响应值的重要因素，本研究采用Waters XBridgeTMHILIC色谱柱，比较了不同定容液对灵敏度的影响，发现采用V（0.2%甲酸）∶V（乙腈）＝10∶90的溶液定容时，色谱峰型和灵敏度最佳。

2.3 样品前处理方法的确定

采用提取剂提取被测样品后，考虑将SPE净化方法作为样品处理的主要方法，但是饲料中特别是预混合饲料中盐分过高，净化过程困难，先后比较了MAX、MCX、CARB等SPE柱净化均未能取得满意的净化效果和回收率，因此采用文献的方法经提取［1，10］，氮气吹干，高速离心后进行净化，得到了较为满意的净化效果。

由于三聚氰胺及其类似物的水溶性较好，提取时往往采用酸性水溶液，如三氯乙酸、甲酸或它们与乙腈组成的混合溶液。本标准比较了不同提取溶液的效果，分别采用1.0%三氯乙酸、V（1.0%三氯乙酸）∶V（乙腈）＝1∶1溶液、2.5%甲酸溶液、V（2.5%甲酸溶液）∶V（乙腈）＝1∶1溶液提取三聚氰胺及其类似物，发现采用V（2.5%甲酸溶液）∶V（乙腈）＝1∶1的溶液提取效果最好。该结果与文献报道的基本一致［1］。由于三聚氰胺和三聚氰酸容易形成聚合物，因此为了尽可能地使被测物以游离形式存在，本研究采用超声提取法，尽量提高被测物的提取效率和聚合物解离。通过土壤和饲料样品的加标实验，表明采用超声提取方法的回收率均在90%以上。由于提取液中有大量的机械杂质，通过高速离心可以有效除去，以达到较好的净化效果。

图2 MRM模式下，三聚氰胺及其类似物标准品色谱图Fig.2 The selected ion chromatogram of melamine and its analogues in MRM mode

2.4 方法线性方程和检出限

配制与检测样品相同基质的混合标准系列工作液，使其浓度为 5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500μg/L，内标物浓度均为50.0μg/L，按1.3建立的仪器条件进行测定。分别以选定的定量离子峰面积与内标物峰面积的比值Y对含量X做标准曲线，采用空白样品中添加目标化合物的方法，按样品处理方法进行处理和检测，以3倍信噪比为检出限（LOD），以10倍信噪比为定量限（LOQ），其结果列于表3。

2.5 加标回收率和精密度实验

在确定样品预处理方法后，取酸性土壤（acid soil，AS）、中性土壤（neutral soil，NS）和碱性土壤（basic soil，BS）作为土壤代表性样品，取猪饲料（swine’s feed，SF）和鸡饲料（chicken’s feed，CF）作为饲料代表性样品，进行加标回收率实验，以考察方法的准确度和重现性，每批次内同一浓度做5次平行实验，回收率结果列于表4。当样品的上机液浓度超过线性范围时，需根据测定量浓度，减少取样量进行重新测定，直至上机液浓度在标准曲线的线性范围内。

表3 三聚氰胺及其类似物的线性方程、相关系数和检出限（n＝6）Table 3 The calibration curves，corelation coeffient and LOD of melamine and its analogues（n＝6）

由实验结果看出，按优化后的样品提取条件和色谱条件测定添加回收量，三聚氰胺、三聚氰酸、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸二酰胺的平均回收率为61.4%～115%，相对标准偏差不大于12.6%。该结果说明，本工作建立的方法对不同含量、不同样品中三聚氰胺及其类似物的测定均有较好的准确度。

2.6 样品分析

利用建立的方法进行了部分样品的摸底检测，土壤样品主要来源于养殖场、种植场和饲料厂等周围的上层、中层和深层土壤，饲料样品包括鱼粉、植物原料饲料和畜禽配合饲料、预混合饲料、浓缩饲料等。结果发现，土壤和饲料样品中普遍存在三聚氰胺和三聚氰酸的污染情况。对196份土壤和230份饲料样品的检测发现：32份土壤样品中检出三聚氰胺，7份土壤样品中检出三聚氰酸，其含量为0.59～41.1mg/kg；25份饲料样品中检出三聚氰胺，1份饲料样品检出三聚氰酸。

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［14］Commission of the European Communities.Implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Council Directive.2002/657/EC Off.J.Eur.Commun.2002，L 222/8.

Simultaneous Determination of Melamine and Its Analogues in Feeds ＆Soils by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YING Yong-fei1，2，ZHU Cong－ying2，WEI Min-jue2，CHEN Hui-hua2，ZHOU Wei2，LIN Xian-jun2，WANG Yi-zhen1（1.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China；2.Animal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province，Hangzhou310020，China）

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-ESI-MS/MS）method for the determination of melamine and its analogues（CYA，AMD，AMN）in feeds ＆soils was reported.The analytes were extracted with the soluction（V（2.5%formic acid）∶V（acetonitrile）＝50∶50）from matrix，and then the extracting solution was evaporated by nitrogen blow，dissolved in the soluction（V（0.2%formic acid）∶V（acetonitrile）＝10∶90）and assayed by LC-MS/MS.The chromatographic retention time and mass fragment ion abundances ratio for qualitative，and with15N3－melamine，13C3－cyanuric acid as internal standard for quantitative.Scanning of positive ions and negative ion scan the instrument method studies，to determine the abundance ratio of the highest two pairs of ions as monitoring ionMRM mode for qualitative and quantitative analysis.The limit of detection （LOD）is 0.25—0.50mg/kg.The correlation coefficient is greater than 0.999within the linear range of 5.0—500.0μg/L.Recoveries of MEL，CYA，AMD and AMN are 61.4%—115%，and the relative standard deviation is less than 12.6%at spiked levels of 0.5—2.0mg/kg（n＝5）.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）；feeds；soils；melamine；analogues

O 657.63

A

1004-2997（2012）06-0342-07

2012-05-28；

2012-10-20

浙江省优先主题重点农业项目（2009C12055），浙江省重点科技创新团队项目（2010R50028）资助

应永飞（1977～），男（汉族），博士研究生，从事饲料安全分析的研究。E-mail：yyf1001＠163.com

汪以真（1965～），男（汉族），博士，教授，从事动物营养与免疫研究。E-mail：yzwang＠zju.edu.cn